編者：資源增量是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保 障。自上世紀(jì) 80 年代以來，我國(guó)老一輩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)家苦心孤詣，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研發(fā)工作中取得的多項(xiàng)開創(chuàng)新成果。
1988年《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動(dòng)我國(guó)科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品 系開發(fā)和動(dòng)物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
斑馬魚在藥物研發(fā)中的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望
張勇
一、斑馬魚的生物學(xué)特征及優(yōu)勢(shì)
斑馬魚是一種原產(chǎn)于南亞地區(qū)的小型熱帶淡水魚，成魚體長(zhǎng)只有 3 厘米左右。斑馬魚發(fā)育速度快，受精后3 天左右主要組織器官發(fā)育已經(jīng)完成，5 天左右開口進(jìn)食，約 3 個(gè)月達(dá)到性成熟，壽命可達(dá) 2 年以上[1]。斑馬魚是體外受精發(fā)育而且胚體透明，組織器官的發(fā)育和變化、血流、心跳等都可以在顯微鏡下直接進(jìn)行觀察。
跟哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚具有飼養(yǎng)密度高（100 ㎡可養(yǎng)殖 2-3 萬(wàn)尾成年斑馬魚、養(yǎng)殖成本低（小鼠的 1/10）、實(shí)驗(yàn)通量高（可在 96 孔板中進(jìn)行高通量分析）、所需要的樣品量少（100mg 以內(nèi)）、便于活體觀察透明、實(shí)驗(yàn)周期短（大部分實(shí)驗(yàn) 5 天以內(nèi)可以完成）、繁殖能力強(qiáng)（每隊(duì)親本一次可繁殖 200 枚左右胚胎）[2]。斑馬魚也更符合動(dòng)物福利保護(hù)的要求。歐盟 2003 年頒布法令，要求從 2013 年起在歐盟禁止開展化妝品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[3]，而在 2010 年歐盟頒布的法令中明確指出，對(duì)于可以自由進(jìn)食之前的斑馬魚（受精后 5 天以內(nèi)）胚胎和幼魚的使用不受歐盟有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)禁令的限制[4]。
此外，不少低毒中藥或保健食品因哺乳動(dòng)物胃容量的限制，給樣劑量有限，常常在在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)難以發(fā)現(xiàn)受試樣品的功效或毒性。斑馬魚實(shí)驗(yàn)通常是將藥物直接溶解到養(yǎng)魚水中，斑馬魚可以持續(xù)從養(yǎng)魚水中攝取藥物， 從而能夠在較短時(shí)間內(nèi)觀察到受試樣品無法在哺乳動(dòng)物上觀察到功效或毒性。目前，在中藥、天然藥物、保健食品以及功能性食品的研究開發(fā)當(dāng)中，斑馬魚的使用越來月廣泛。
二、國(guó)際上斑馬魚的應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)
斑馬魚作為一種脊椎類模式動(dòng)物在二十世紀(jì)九十年代開始進(jìn)入新藥研發(fā)領(lǐng)域，現(xiàn)已在歐美國(guó)家廣泛應(yīng)用于 人類疾病模型研究、新藥篩選、藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)，應(yīng)用領(lǐng)域覆蓋了腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝系統(tǒng)疾病以及抗炎與免疫系統(tǒng)疾病等幾乎所有的人類疾病領(lǐng)域[2, 5-8]。
腫瘤領(lǐng)域。眾多的研究成果表明斑馬魚模型在癌癥發(fā)病機(jī)理研究和抗癌藥篩選方面具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)10],Stoletov等人用斑馬魚研究清晰地揭示了腫瘤細(xì)胞通過血管向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的機(jī)制[11]。斑馬魚模型目前已被廣泛[9]應(yīng)用于篩選抑制血管形成的靶向抗癌藥[12,13]，斑馬魚人類腫瘤移植模型也被大量用于抗腫瘤藥物功效評(píng)價(jià)心血管疾病領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚心臟功能和心電圖與人的高度相似性，斑馬魚模型在篩選和評(píng)價(jià)心律不齊藥物方面的結(jié)果具有很好的特異性和可靠性[16-18]。斑馬魚在研究心衰和篩選治療心衰藥物方面同樣具有很大的價(jià)值[19]，筆者所在的研究團(tuán)隊(duì)分別用特非那定[20]和維拉帕米[21]建立了兩種不同機(jī)制的斑馬魚心衰模型，并且評(píng)價(jià)了芪藶強(qiáng)心膠囊、參麥注射液、厄貝沙坦、沙庫(kù)巴曲纈沙坦鈉片（LCZ696)等八種已上市心衰治療藥物， 發(fā)現(xiàn)斑馬魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床結(jié)果具有很好的一致性。斑馬魚也被廣泛用于血栓形成研究以及抗血栓藥物篩選23]，通過苯肼誘發(fā)的紅細(xì)胞損傷性血栓模型和通過花生四烯酸誘發(fā)的血小板聚集性血栓模型在已上市的抗血栓中藥和化藥的藥效評(píng)價(jià)中都表現(xiàn)出了很好的相關(guān)性[24-26]。
神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域。斑馬魚很早就被用于癲癇研究和抗癲癇藥物篩選[27-29]，用斑馬魚癲癇模型對(duì)已上市的13 種抗癲癇進(jìn)行的藥效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了撲米酮之外，其它 12 種藥物在斑馬魚模型上都有明顯的抗癲癇作用[27]。此外，斑馬魚在阿爾茲海默癥領(lǐng)域也有較多的研究，包括對(duì)乙酰膽堿系統(tǒng)、Tau蛋白磷酸化以及β淀粉樣蛋白對(duì)斑馬魚腦部神經(jīng)和行為學(xué)的影響[30-33]，也用斑馬魚阿爾茲海默癥模型進(jìn)行了藥物篩選和評(píng)價(jià)研究[34]。 斑馬魚也用于神經(jīng)生長(zhǎng)與保護(hù)[35-37]、帕金森癥[38]、多發(fā)性硬化[39]以及焦慮和認(rèn)知障礙研究[40]。
代謝性疾病領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚對(duì)血糖的調(diào)控機(jī)制與哺乳動(dòng)物相似[41]，已上市的幾種Ⅱ型糖尿病治療藥物都能顯著降低斑馬魚高模型的血糖[42]。同時(shí)，斑馬魚也被用于研究胰腺 β 細(xì)胞再生的機(jī)制并用于篩選促進(jìn)胰腺β細(xì)胞再生的化合物[43]。斑馬魚在脂肪代謝方面的研究比糖代謝方面的研究更多[44]，斑馬魚被用于研究促進(jìn)體內(nèi)脂肪代謝進(jìn)而開發(fā)減肥藥物的研究[45]、用于篩選食物脂肪吸收抑制劑[46]、用于篩選和評(píng)價(jià)能夠降低體內(nèi)膽固醇水平的藥物[47,48].
毒性評(píng)價(jià)方面。斑馬魚模型可以快捷、高效、直觀地評(píng)價(jià)藥物的心血管毒性、肝臟毒性、發(fā)育毒性、腎毒性和神經(jīng)毒性等多個(gè)主要組織和器官毒性。斑馬魚對(duì)藥物心血管毒性的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性可以高達(dá)95%以上[16, 50, 51]，對(duì)藥物肝毒性的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性可以達(dá)到 85%左右[52-54]，對(duì)發(fā)育毒性的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性可以達(dá)到 80%以上[55, 56]。已有的 大部分斑馬魚藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率已達(dá)到了“良好” （good）（75-85%）或優(yōu)秀（excellent）（85%）的水平[57]。斑馬魚藥物毒性評(píng)價(jià)技術(shù)的應(yīng)用完善了整個(gè)臨床前藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)體 系，可以加快臨床前毒性評(píng)價(jià)的速度，降低臨床前毒性評(píng)價(jià)的費(fèi)用，提高新藥研發(fā)成功率。
斑馬魚高通量、自動(dòng)化藥物篩選也在不斷創(chuàng)新和發(fā)展，無論是斑馬魚高通量病理切片方法的研究[58]、行為學(xué)自動(dòng)分析設(shè)備的開發(fā)[59]、自動(dòng)化拍照設(shè)備的改進(jìn)[60]，還是基于斑馬魚體內(nèi)熒光報(bào)告蛋白信號(hào)的自動(dòng)化分析設(shè)備的開發(fā)[61]，都將極大地推動(dòng)斑馬魚模型在藥物篩選與研發(fā)階段的更廣泛應(yīng)用。
2009 年歐洲的一家斑馬魚藥物篩選技術(shù)服務(wù)公司 Biobide（www.biobide.es）獲得了美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）和歐洲藥品評(píng)估局（EMEA）的 GLP 認(rèn)證，標(biāo)志著斑馬魚藥物毒理學(xué)與安全性評(píng)價(jià)模型已經(jīng)得到了歐美國(guó)家政府的正式認(rèn)可。美國(guó) FDA 也在其官網(wǎng)上刊文介紹斑馬魚在藥物安全性評(píng)價(jià)方面的積極作用和價(jià)值（https://www.fda.gov/forconsumers/consumerupdates/ucm343940）。
三、斑馬魚技術(shù)在我國(guó)藥物研發(fā)中的應(yīng)用現(xiàn)狀
斑馬魚在我國(guó)用于藥物研發(fā)的時(shí)間相對(duì)較晚，大概開始于 2006 年前后，而且主要是以對(duì)中藥材為主的天然藥物活性成分的研究為主。這主要跟我國(guó)藥物研發(fā)的現(xiàn)狀和特色有關(guān)，由于我們化藥研發(fā)起步較晚，我國(guó)的 絕大部分化藥企業(yè)沒有自己的藥物篩選候選化合物庫(kù)，而國(guó)外大型醫(yī)藥企業(yè)通常擁有多達(dá)上百萬(wàn)小分子化合物庫(kù)，這決定了我國(guó)化藥研發(fā)領(lǐng)域?qū)Π唏R魚模型需求相對(duì)較少。
包括中醫(yī)在內(nèi)的民族藥在我國(guó)有幾千年的使用歷史，積累和形成了包括中醫(yī)理論、藏醫(yī)理論在內(nèi)的大量寶貴的天然藥用資源使用經(jīng)驗(yàn)和理論，這為我們用斑馬魚進(jìn)行天然藥用資源提供了得天獨(dú)厚的機(jī)會(huì)。跟國(guó)外科學(xué) 家通常是以從天然藥物資源中分析單體活性成分為目的不同，我國(guó)的天然藥用資源開發(fā)在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，更加注重多種功效成分的協(xié)同作用，而基于生物整體反應(yīng)的功效評(píng)價(jià)正是斑馬魚的突出優(yōu)勢(shì)。
早期，我國(guó)藥物研發(fā)領(lǐng)域的科研工作者對(duì)斑馬魚的使用主要集中在天然產(chǎn)物的毒性和安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域，而且所做的工作相對(duì)比較簡(jiǎn)單，以簡(jiǎn)單的死亡率觀察、心臟毒性、明顯的形態(tài)學(xué)觀察以及病理觀察為主，研究成果主要發(fā)表在國(guó)內(nèi)期刊[62-65]。2010 年前后，有一些國(guó)內(nèi)的科研團(tuán)隊(duì)開始用斑馬魚進(jìn)行發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性那個(gè)的研究，成果也在國(guó)外期刊發(fā)表[66,67]。同時(shí)，也開始有科研團(tuán)隊(duì)開始將斑馬魚應(yīng)用于功效評(píng)價(jià)，早期的功效評(píng)價(jià)以抗血管形成活性為主[68-71]。從 2012 年之后，國(guó)內(nèi)用斑馬魚進(jìn)行藥物研發(fā)的團(tuán)隊(duì)明顯增多，而且更多的研究方向集中在了功效評(píng)價(jià)和活性物質(zhì)篩選上，功效評(píng)價(jià)的范圍也從抗血管形成擴(kuò)展到了促血管形成[71,72]、抗炎[73,74]、抗骨質(zhì)疏松[75]、行為學(xué)研究[76]、抗血栓[77] 以及中藥代謝研究[78]等領(lǐng)域。此外，斑馬魚在中藥生物學(xué)質(zhì)量控制方法方面也已經(jīng)進(jìn)行了一些有益的探索[36,79]。
隨著國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目從十二五開始對(duì)斑馬魚藥物研究技術(shù)進(jìn)行資助以來，國(guó) 內(nèi)有越來越多的單位開始籌建斑馬魚藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，特別是在中藥和天然藥物研發(fā)領(lǐng)域。“重大新藥創(chuàng)制”專項(xiàng)的支持對(duì)于推動(dòng)斑馬魚在我國(guó)藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用起到了非常重要的作用，專項(xiàng)支持不僅給更多單位籌建 斑馬魚實(shí)驗(yàn)室提供了經(jīng)費(fèi)支持，也從國(guó)家層面推動(dòng)了斑馬魚藥物研發(fā)技術(shù)在國(guó)內(nèi)的認(rèn)可、接受與應(yīng)用。國(guó)內(nèi)已經(jīng)涌現(xiàn)出了像杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、廣東省人類疾病斑馬魚模型與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等一批在國(guó)內(nèi)外具有一定學(xué)術(shù)影響力和產(chǎn)業(yè)服務(wù)能力的斑馬魚技術(shù)平臺(tái)。目前，我國(guó)已經(jīng)有多個(gè)創(chuàng)新 藥物項(xiàng)目將斑馬魚數(shù)據(jù)用于中國(guó)新藥臨床試驗(yàn)申報(bào)，并已有 2 個(gè)項(xiàng)目獲得了臨床批件。
四、展望
目前，國(guó)際上化學(xué)藥物開發(fā)已經(jīng)逐步并可能完全轉(zhuǎn)向基于靶向設(shè)計(jì)的藥物研發(fā)思路，斑馬魚在化學(xué)藥物研發(fā)的應(yīng)用預(yù)計(jì)不會(huì)出現(xiàn)非常大的增長(zhǎng)；隨著斑馬魚毒性替代模型的深入推廣和應(yīng)用，斑馬魚在化學(xué)藥物早期安全性評(píng)價(jià)中使用應(yīng)該會(huì)有所增加。
從長(zhǎng)期來看，多組分、多靶點(diǎn)的多組分藥物開發(fā)會(huì)成為一個(gè)趨勢(shì)，這里既包括人為選擇化學(xué)單體藥物進(jìn)行組合，也包括從天然藥物篩選、發(fā)現(xiàn)多組分活性成分。而對(duì)于多組分藥物而言，體外篩選的結(jié)果預(yù)測(cè)性有限，哺乳動(dòng)物的時(shí)間和費(fèi)用成本太高，斑馬魚模型能夠發(fā)揮更大作用。
此外，隨著國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重視，中醫(yī)藥行業(yè)提升自身水平，加強(qiáng)對(duì)中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制正在逐步成為業(yè)內(nèi)共識(shí)。而目前基于化學(xué)成分檢測(cè)的質(zhì)量控制體系并不能完全反映出中藥產(chǎn)品的質(zhì)量好壞與穩(wěn)定性，生物活性測(cè)定方法具有整體可控、藥效相關(guān)等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，作為符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的適用質(zhì)量控制方法已成為中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的重要發(fā)展方向之一，《中國(guó)藥典》2020年版編制大綱指出：“重點(diǎn)開展基于中醫(yī)臨床療效的生物效價(jià)和測(cè)定方法研究，探索建立以形態(tài)、顯微、化學(xué)成分和生物效應(yīng)相結(jié)合的能整體體現(xiàn)中藥療效的標(biāo)準(zhǔn)體系”。
考慮到中藥成分的多樣性和作用機(jī)制的復(fù)雜性，體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性有限，而哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并不適合用于大批次的常規(guī)檢測(cè)，相信斑馬魚在中藥質(zhì)量控制體系中能夠有自己用武之地。
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