編者：資源增量是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀(jì)80 年代以來，我國(guó)老一輩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)家苦心孤詣，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研發(fā)工作中取得的多項(xiàng)開創(chuàng)新成果。
1988 年《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動(dòng)我國(guó)科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品系開發(fā)和動(dòng)物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
實(shí)驗(yàn)用果蠅的標(biāo)準(zhǔn)化
倪健泉
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系
黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）是100 多年前由Thomas Hunt Morgan 引入，作為模式生物進(jìn)行科學(xué)研究的(Morgan, 1910)。此后，隨著遺傳學(xué)方法的發(fā)展，果蠅引領(lǐng)了許多生物學(xué)新發(fā)現(xiàn)(Bellen et al., 2010)。
如今，果蠅已經(jīng)被廣泛用于各個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域，包括人類疾病和治療方法的研究(Pandey and Nichols, 2011)。
一、果蠅的主要生物學(xué)特性
1、基本生物學(xué)特性
果蠅成蟲身長(zhǎng)約2-2.5mm，雌性約重1.4mg，雄性約重0.8mg(Ong et al., 2015)。在10℃-30℃溫度區(qū)間果蠅可以生存，溫度越高，其生命周期越短(賀爭(zhēng)鳴等, 2016.5)。25℃培養(yǎng)條件下，果蠅生命周期（從胚胎發(fā)育到成蟲）約10 天，其中胚胎、幼蟲、蛹分別經(jīng)歷約1d、5d、4d(張鵬飛，毛玉蕊，楊繞華，孟琳琳，王進(jìn)忠，魏艷敏, 2010)。羽化后24 小時(shí)內(nèi)果蠅即可交配，交配后雌果蠅每天可產(chǎn)卵達(dá)100 枚。條件適宜、營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，果蠅壽命可達(dá)2-3 個(gè)月。
2、果蠅的飼養(yǎng)和遺傳學(xué)操作
根據(jù)日常需要，果蠅可飼養(yǎng)于培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶中，底部放置玉米面、白糖、瓊脂、抗生素等制備的培養(yǎng)基(王霞，喬歡歡，潘麗霞，任興杰，孫錦，徐榮剛，劉魯萍，賀爭(zhēng)鳴，倪建泉, 2016)。由于目前尚無有效的冷凍并復(fù)蘇成蟲或幼蟲的方法，因此世界上各大果蠅資源中心以及1800 多個(gè)果蠅實(shí)驗(yàn)室的種質(zhì)資源保存都采用持續(xù)將成蟲轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的方法。實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)保存可將果蠅飼養(yǎng)于18℃、60%濕度、12h/12h 交替光照的培養(yǎng)箱或房間，則其生命周期可達(dá)20 天左右，可一個(gè)月傳代一次。實(shí)驗(yàn)用果蠅飼養(yǎng)于18℃/25℃/29℃、60%濕度、12h/12h 交替光照的培養(yǎng)箱或房間，可利用不同溫度實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ɡ缈刂艷al4 表達(dá)量、控制Gal80ts 表達(dá)等）。實(shí)驗(yàn)完成后，將廢棄果蠅連同培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶放入-20℃冰箱冷凍過夜，保證果蠅全部死亡后，可作為普通實(shí)驗(yàn)垃圾處理。
進(jìn)行遺傳學(xué)操作時(shí)，傳統(tǒng)方法是使用乙醚或乙醚與乙醇混合物將果蠅麻醉后再進(jìn)行，但是存在麻醉效果不好、昏迷時(shí)間短、復(fù)蘇率低、對(duì)人體安全性差等問題。目前大部分果蠅實(shí)驗(yàn)室采用高壓二氧化碳?xì)怏w，經(jīng)過減壓閥處理后，通過麻醉槍和通氣麻醉平板進(jìn)行果蠅麻醉處理。同時(shí)配套使用壁式加濕系統(tǒng)對(duì)二氧化碳進(jìn)行預(yù)加濕，避免操作過程中靜電的影響。該方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)果蠅無傷害，且去除二氧化碳后果蠅復(fù)蘇迅速。
3、果蠅基因組及染色體
果蠅是最好的遺傳學(xué)研究工具之一。一方面，果蠅基因組僅由四條染色體組成，遺傳學(xué)操作簡(jiǎn)單；而且果蠅基因組已經(jīng)全部進(jìn)行了測(cè)序和注釋(Adams et al., 2000)，遺傳背景清楚。另一方面，果蠅擁有成熟、強(qiáng)大的遺傳學(xué)工具體系和品系資源，比如Gal4/UAS 系統(tǒng)、嵌合體技術(shù)、近年來發(fā)展起來的基因組編輯和基因激活技術(shù)，以及轉(zhuǎn)基因干擾品系資源庫等，這是其他模式生物望塵莫及的。果蠅基因組編碼14000 多個(gè)基因，其中95％的基因集中在X、Ⅱ和Ⅲ號(hào)染色體上(Emameh et al., 2015; Ong et al., 2015)。這些基因與人類高度同源：50%以上的果蠅基因與人類同源，而75%以上的人類致病基因能在果蠅中找到同源物(Emameh et al.,2015; Sun et al., 2013)。果蠅基因不僅與人類基因序列保守，功能上也具有非常高的相似性。比如，參與基因表達(dá)和代謝調(diào)節(jié)的許多果蠅蛋白質(zhì)與人類對(duì)應(yīng)物具有密切的相似性。此外，基因組分析顯示，果蠅中很多重要生化途徑的生物合成網(wǎng)絡(luò)與人類具有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系(Ong et al., 2015)。一百多年以來，利用果蠅進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究做出了許多開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，例如干細(xì)胞微環(huán)境的概念最初就是在果蠅中提出的。
二、實(shí)驗(yàn)用果蠅的要求
實(shí)驗(yàn)用果蠅一般需從國(guó)際公認(rèn)的果蠅資源中心訂購，如美國(guó)的Bloomington Drosophila Stock Center、日本的NIG、以及我國(guó)的清華大學(xué)果蠅中心，以保證基因型正確、遺傳背景清晰、無微生物（細(xì)菌、霉菌、螨蟲等）污染。引入果蠅后，需對(duì)果蠅的表型進(jìn)行確認(rèn)，必要時(shí)可結(jié)合PCR、測(cè)序等方式進(jìn)一步確認(rèn)。此外，將果蠅飼養(yǎng)于合適溫度和濕度條件，保證其長(zhǎng)勢(shì)良好。使用前，需要經(jīng)過正規(guī)的隔離檢查，保證無污染后方可放入實(shí)驗(yàn)室正式使用。我國(guó)目前尚無針對(duì)實(shí)驗(yàn)用果蠅的技術(shù)規(guī)范和明確規(guī)定，相關(guān)規(guī)定參照國(guó)家檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布和實(shí)施的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引種技術(shù)規(guī)程》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)粒控制要求》等文件。
三、實(shí)驗(yàn)用果蠅的應(yīng)用研究
果蠅飼養(yǎng)容易、生命周期短，與其他短世代模型生物相比，卻擁有更多的組織和細(xì)胞類型，以及豐富的、方便觀察的表型和個(gè)體行為，因此為生命發(fā)育、成體健康、個(gè)體行為甚至進(jìn)化等科學(xué)問題的探索提供理想的材料。此外，百余年來積累的遺傳學(xué)方法和資源為眾多生物過程的研究提供了巨大的便利。利用果蠅進(jìn)行的研究使我們?cè)谶z傳學(xué)、細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和行為學(xué)、分子生物學(xué)、進(jìn)化學(xué)和人口遺傳學(xué)，以及其他領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步(Hales et al., 2015)。
利用模式生物進(jìn)行生命科學(xué)研究的最終目的是服務(wù)人類，幫助預(yù)防和治療人類重大疾病。果蠅不僅在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域至關(guān)重要，加深了我們對(duì)于眾多生物過程中信號(hào)通路和分子機(jī)制的理解，而且在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也為人類疾病的干預(yù)策略提供了重要的參考依據(jù)。利用果蠅，研究人員建立了許多人類重大疾病模型，并用于探究發(fā)病機(jī)理和治療措施。例如，隨著老年人口比例增加，全世界神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率逐年增加，給家庭和社會(huì)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。針對(duì)此問題，通過過表達(dá)人源顯性可遺傳疾病基因，建立了一系列神經(jīng)退行性疾病的果蠅模型，包括阿爾茲海默癥、帕金森綜合征和亨廷頓舞蹈癥。這些疾病模型不僅能夠在組織和細(xì)胞水平上模仿人類的主要病理特征，還能通過幼蟲和成蟲的嗅覺學(xué)習(xí)、求偶、攻擊和晝夜節(jié)律等行為從系統(tǒng)水平模擬人類神經(jīng)退行性疾病的功能退化(Fernandez-Funez et al., 2015; Rincon-Limas et al., 2012)。利用這些模型進(jìn)行的研究，不僅加深了人們對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展過程的理解(Bodai et al., 2012; Campesan et al., 2011; Fernandez-Funezet al., 2015; Varga et al., 2014)，而且為探索疾病的治療方法做出了巨大的貢獻(xiàn)(Jansen et al., 2014;McGurk et al., 2015)。
除了神經(jīng)退行性疾病，在果蠅中建立模型并進(jìn)行深入研究的人類疾病還有免疫類疾病如哮喘、病原菌感染疾病、金屬中毒等(Calap-Quintana et al., 2017; Lestradet et al., 2014; Roeder et al., 2012)，代謝類疾病如肥胖及糖尿病、高糖飲食引發(fā)的心血管疾病等(Na et al., 2013; Teleman et al., 2012)，腫瘤如眼睛腫瘤、腸道腫瘤、卵巢腫瘤等(Bennett et al., 2015; Eliazer et al., 2011; Kirilly and Xie, 2007;Markstein et al., 2014; Richardson and Portela, 2018; Song and Lu, 2011; Sonoshita and Cagan, 2017;Yang et al., 2017)，以及衰老、皮膚病等其他疾病研究(Bohnekamp et al., 2015; Brandt and Vilcinskas,2013)。果蠅疾病模型不僅可以在細(xì)胞和分子水平上很好地模擬人類發(fā)病機(jī)制，而且利于進(jìn)行行為學(xué)觀察和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其強(qiáng)大的遺傳學(xué)工具和品系資源更是為揭示參與疾病的基因、信號(hào)通路、開發(fā)疾病治療方法并應(yīng)用到人類提供了極大的便利。
四、實(shí)驗(yàn)用果蠅種群的建立與意義
近二十年來基因組學(xué)的發(fā)展一方面使人們得到了各物種全基因組序列，另一方面對(duì)于這些零碎化的基因序列及其功能的認(rèn)識(shí)和解讀卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。作為研究最深入的多細(xì)胞生物和可靠的人類疾病模型，果蠅中表型明確的基因也僅僅占其基因組編碼基因的約15%(Perkins et al., 2015)。因此，大量功能未知的基因和信號(hào)通路及其相互之間的作用關(guān)系仍需我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>
百余年來，果蠅在各生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究經(jīng)久不衰，除了其自身生物學(xué)特性外，最突出的優(yōu)勢(shì)便是一百年來果蠅研究積累的強(qiáng)大的遺傳學(xué)工具及品系資源。例如，轉(zhuǎn)基因RNAi 技術(shù)的出現(xiàn)使得我們可以及其便利地實(shí)現(xiàn)體內(nèi)單個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控。為了更加便利地實(shí)現(xiàn)全基因組任何一個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控和研究，果蠅全基因組水平的轉(zhuǎn)基因RNAi 品系也應(yīng)運(yùn)而生，它們存在于奧地利的VDRC（http://stockcenter.vdrc.at/control/main）、日本的NIG（http://www.shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/index.jsp）、美國(guó)的BDSC（https://bdsc.indiana.edu/index.html）和中國(guó)的THFC（http://fly.redbux.cn/）。這些品系涵蓋了絕大部分果蠅基因，能夠滿足大部分研究人員需要。以BDSC 為例，她擁有11000 多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因RNAi 品系，覆蓋了71%的果蠅編碼基因(Perkins et al., 2015)。在RNAi 品系的技術(shù)原理方面，VDRC 和NIG 主要是利用前兩代果蠅轉(zhuǎn)基因RNAi 技術(shù)構(gòu)建的長(zhǎng)鏈RNA 干擾品系，BDSC 主要是利用第三代轉(zhuǎn)基因RNAi 技術(shù)構(gòu)建的短鏈發(fā)卡RNA 干擾品系。清華果蠅中心（THFC）在原有8000 余株從TRiP 引進(jìn)的品系外，又利用自主研發(fā)的新一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)構(gòu)建了3000 余株與人類高度同源基因及重大疾病基因的新轉(zhuǎn)基因干擾品系（Qiao Huanhuan etal., Nature Communications, accepted）。與原有前三代RNAi 技術(shù)構(gòu)建的品系相比，這些新品系降低了與Gal4 雜交前的本底表達(dá)，提高了RANi 誘導(dǎo)后的基因敲低效率，并且實(shí)現(xiàn)了一次性敲低多個(gè)基因，因此尤其適合那些高表達(dá)、高拷貝的基因以及蛋白質(zhì)復(fù)合體的研究。
近幾年來，基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)及基因轉(zhuǎn)錄激活技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，使得果蠅基因表達(dá)調(diào)控方式更加多元化，為基因功能的研究提供了新的選擇。其中，基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高效的基因突變、插入和同源重組(Ren et al., 2013; Ren et al., 2014a; Ren et al., 2014b)。清華大學(xué)果蠅中心與哈佛醫(yī)學(xué)院合作研發(fā)的CRISPR/dCas9 介導(dǎo)的VPR 及系列flySAM 系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)高效的基因原位激活。隨著果蠅遺傳學(xué)新技術(shù)的不斷更新，配套的全基因組果蠅品系資源也成為新的迫切需求。實(shí)際上，將Gal4/UAS 系統(tǒng)與CRISPR/Cas9 技術(shù)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)組織特異性的基因敲除或基因激活，并且其特異性單純地由sgRNA 決定，因此適用于高通量、全基因組的基因增強(qiáng)品系的構(gòu)建(Ewen-Campen et al., 2017; Jia et al.,2018; 徐榮剛，王霞，王芳，孫錦，毛德才，喬歡歡，賈豫，朱芮葆，彭娉，劉魯萍，倪建泉, 2018)。
目前，哈佛醫(yī)學(xué)院TRiP 中心正在陸續(xù)構(gòu)建覆蓋全基因組的基因突變和基因激活的sgRNA 品系，通過與阻止特異性Gal4 雜交，即可在后代果蠅中實(shí)現(xiàn)高效的基因突變或激活（https://fgr.hms.harvard.edu/trip-crispr-toolbox-fly-stocks）。不久的將來，研究人員將可以通過BDSC 果蠅中心輕松查詢和訂購所需sgRNA 轉(zhuǎn)基因果蠅品系，實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除或激活。這些果蠅品系資源將與轉(zhuǎn)基因干擾品系結(jié)合使用，為果蠅研究提供重要的技術(shù)資源，使各個(gè)領(lǐng)域的研究達(dá)到事半功倍的效果。
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