隨著酶聯(lián)免疫分析技術在醫(yī)學及生物學領域的廣泛應用，使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體。但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半衰期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。上世紀80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術。
1.培養(yǎng)板的預處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5mL 0.2%戊二醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；
2.抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5mL，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；
3.制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出脾臟，置于加有Hanks液的小平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號注射器針頭破少許脾被膜后，感觸細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取綠葉，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，細胞計數(shù)后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；
4.往各孔中加入0.5mL含不同濃度(104-106/mL )的細胞懸液，置37℃，5% CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；
5.往各孔中加入0.5mL生物素化抗體 (Bio-Ab) (2mg/mL)，37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；
6.加入辣根過氧化物酶結合的親和素 (Avi-HRP) (2mg/mL)，37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；
7.配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mL TMB溶液 (4mg/mL甲醇溶液) 滴加如7.5mL 10%明膠溶液 (用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配置) 邊加邊攪，溶液呈白色，加入14mL 3% H2O2；
8.顯示與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6mL明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色斑點。
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