慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。對于一些較難轉染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉導效率,而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加,這就為RNAi、cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞,通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率,以達到目的基因的高效瞬時表達
慢病毒包裝系統一般由慢病毒表達載體和慢病毒包裝載體組成。慢病毒表達載體,即通常所說的穿梭載體,包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。
實驗流程
1. 根據目的基因相關信息(序列,序列號等),構建含有外源基因或siRNA的重組載體;
2. 對于測序正確的重組質粒,提取和純化高質量的不含內毒素的重組質粒;
3. 使用高效重組載體和病毒包裝質粒共轉染293T 細胞,進行病毒包裝和生產,收集病毒液;
4. 濃縮、純化病毒液;
5. 用高質量的病毒液感染細胞;
6. 通過定量PCR精確測定病毒滴度(高精確滴定方法)和Western 分析實驗結果;
7. 用高質量的病毒液感染宿主細胞;檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進行穩定轉染細胞株的篩選,通常狀況下,篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實驗。 拓普生物提供慢病毒載體構建,RNAi(shRNA)、miRNA、過表達和干擾慢病毒包裝,以及基于慢病毒技術的穩定細胞系構建服務。拓普生物慢病毒包裝特點:
1.采用第三代4質粒慢病毒包裝系統,生物安全性更高;2.采用VSV-G包膜,宿主范圍更廣;3. 產生的慢病毒滴度高,可達108~1010TU/mL;4.各種慢病毒穿梭載體可供選擇:過表達、ShRNA、miRNA、Tet誘導表達載體等;5.可帶有熒光報告基因(GFP、RFP、mCherry、Luciferase等)和藥篩標記基因(Puro、Neo、Hygromycin等),有多種啟動子(CMV、PGK、CAG、Ubc等)可供選擇;6.4~5周內即可完成載體構建以及病毒包裝服務。