細胞轉染的基本原理是將外源的DNA克隆到載體上后導入細胞,借助宿主細胞表達載體上的目的片段,從而使目的基因在細胞中發揮功能。目前轉染方法有多種,如脂質體轉染法、磷酸鈣-DNA共沉淀法、電穿孔轉染法、腺病毒感染等。
常規轉染技術可分為兩大類,一類是瞬時轉染,另一類是穩定轉染。瞬時轉染的外源DNA不整合到宿主的染色體中,通常表達只持續幾天,一般在轉染24-72小時后檢測。穩定轉染的外源DNA將整合到宿主染色體中,可持續性表達,一般用于穩定細胞株的構建。
l 脂質體轉染(瞬轉)
1.載體構建(可選),RNAi合成(視轉染情況而定);
2.將細胞按照1~3x105接種到6孔板中,加入2~4mL的完全培養基,混勻放置在二氧化碳培養中,37℃過夜;
3.無菌狀態下配置如下液體:
a.用100μL的Opti-MEM培養基稀釋2μg的待轉染質粒;
b.用100μL的Opti-MEM培養基稀釋25μL的Lipofectamine轉染試劑;
4.將a, b液混合并混勻,室溫放置15min;
5.細胞培養至80%單層左右,用Opti-MEM培養基洗滌細胞兩次,每孔加入1mL Opti-MEM培養基,并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔中,按十字方向輕搖混勻,二氧化碳培養箱中培養;
6. 4-6小時后將轉染液吸出,換為新的完全培養基繼續培養,培養3-4天后檢測蛋白表達量。
l 腺病毒轉染(瞬轉)
1.腺病毒質粒構建;
2.以脂質體轉染的方法包裝腺病毒,測其滴度;
3.不同MOI下測試得最佳轉染效率值;
4.使用最佳MOI對細胞進行轉染。
l 慢病毒轉染(穩轉)
1.慢病毒質粒構建;
2.以脂質體轉染的方法包裝慢病毒,測其滴度;
3.不同MOI下測試得最佳轉染效率值;
4.使用最佳MOI對細胞進行轉染;
5.進行穩轉株篩選。