乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，據(jù)估計(jì)，在較發(fā)達(dá)地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率為74.1%，病死率為14.9%，是繼肺癌之后的第二大常見惡性腫瘤和第五大致死疾病。盡管現(xiàn)在的醫(yī)療水平提高了乳腺癌的檢出率及治療效果，但是仍然有部分患者不能從中獲益，其主要原因是乳腺癌發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)是機(jī)體重要的外周免疫器官，在免疫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，當(dāng)細(xì)菌或病毒入侵人體時(shí)，淋巴結(jié)能夠抵抗及清除外來異物，減少機(jī)體出現(xiàn)感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。然而，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞能夠進(jìn)入淋巴管再通過淋巴液遷移到引流淋巴結(jié)中，并且在引流淋巴結(jié)中增殖，使引流淋巴結(jié)發(fā)生病變，甚至還能從引流淋巴結(jié)中逃逸擴(kuò)散到其他器官。臨床上，淋巴結(jié)的狀態(tài)作為分期預(yù)后因素的診斷價(jià)值已被廣泛重視，并且對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否以及轉(zhuǎn)移程度的評(píng)價(jià)將決定患者的后續(xù)治療。因此在腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，淋巴結(jié)在抗腫瘤免疫中發(fā)揮的作用以及在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后如何對患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療仍需進(jìn)一步研究。
為了對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行深入研究，目前急需建立穩(wěn)定成熟的動(dòng)物模型，重現(xiàn)臨床上乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，以期后續(xù)開展腫瘤學(xué)相關(guān)基礎(chǔ)研究解決臨床上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一實(shí)際難題。目前針對建立腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型主要有舌下接種法、腳掌接種法、睪丸內(nèi)接種法、骨髓內(nèi)接種法、背部接種法及耳部接種法等，基于其使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的多樣性及實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性和穩(wěn)定性，期望通過總結(jié)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對小鼠的不同部位進(jìn)行荷瘤建立不同的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，并通過操作可行性、腫瘤生長速度、淋巴結(jié)病理檢測及小鼠生存等綜合評(píng)價(jià)不同建模方式的優(yōu)劣性，從而篩選出最穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型，為乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為臨床準(zhǔn)確評(píng)估患者風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后提供參考。
建模方法：
PyMT小鼠自發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型
MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型是通過植入PyMT基因到乳腺特異性啟動(dòng)子腺病毒（MMTV）的表達(dá)載體中建立的。乳腺特異性啟動(dòng)子的作用使得PyMT基因在小鼠乳腺組織中高表達(dá)，從而使小鼠出現(xiàn)乳腺腫瘤的表型。利用該小鼠自發(fā)乳腺癌的特性來觀察其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律。通過對病理切片進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)該淋巴結(jié)形成了明顯的巢狀腫瘤，結(jié)構(gòu)破壞明顯，濾泡數(shù)量減少，髓竇形態(tài)明顯改變，可以看到淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞形成了明顯的分界線。結(jié)果提示MMTV-PyMT小鼠發(fā)生了腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為100%，成瘤率也為100%，MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有自發(fā)性轉(zhuǎn)移、可重復(fù)性和接近病理狀態(tài)的特點(diǎn)，提示其是一個(gè)理想的乳腺癌淋巴結(jié)自發(fā)轉(zhuǎn)移研究模型。
腹股溝淋巴結(jié)-對側(cè)淋巴結(jié)型
將BALB/c小鼠后肢腹部和腿部備毛后，對小鼠進(jìn)行麻醉處理，使用無菌剪刀和鑷子在其腹股溝處剪開約1 cm的小口，取4T1細(xì)胞懸液5 μL，共計(jì)5×105個(gè)細(xì)胞，使用一次性無菌胰島素注射針將細(xì)胞懸液接種于小鼠腹股溝處淋巴結(jié)中。在細(xì)胞懸液進(jìn)入淋巴結(jié)后，可觀察到淋巴結(jié)明顯凸起，以此確定腫瘤細(xì)胞懸液在小鼠淋巴結(jié)內(nèi)注射成功。通過對病理切片分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)內(nèi)部組織已經(jīng)壞死，并且形成較多空泡，淋巴結(jié)中存在大量的細(xì)胞核碎片；從細(xì)胞核形態(tài)上判讀，應(yīng)是腫瘤細(xì)胞來源，說明此時(shí)該模型已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但由于取材時(shí)間太晚，腫瘤組織已經(jīng)破壞，未能觀察到界限清楚的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，此時(shí)的淋巴結(jié)已經(jīng)隨著腫瘤細(xì)胞的侵襲發(fā)展為淋巴瘤。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)該荷瘤模型的操作方法難度較大，荷瘤成功率僅為50%。因此，該模型的構(gòu)建對操作者技術(shù)要求較高，重復(fù)性較低，易操作失誤形成皮下瘤，不能成功建立模型。
腿部-腹股溝淋巴結(jié)模型
取4T1細(xì)胞懸液100 μL，含5×105個(gè)細(xì)胞，使用一次性無菌胰島素注射針皮下接種于BALB/c小鼠左后肢大腿處。通過對病理切片分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)已經(jīng)被腫瘤細(xì)胞侵襲形成了腫瘤亮區(qū)。內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞大小、形態(tài)差異大，沒有形成腺體樣結(jié)構(gòu)，但明顯不同于正常的淋巴細(xì)胞。對病理切片進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤細(xì)胞的侵襲在淋巴結(jié)內(nèi)形成了2個(gè)轉(zhuǎn)移灶，如圖3B中黑色實(shí)線圈畫部分所示。同時(shí)通過對比前哨淋巴結(jié)（SLN）和對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）質(zhì)量發(fā)現(xiàn)引流淋巴結(jié)的質(zhì)量顯著增加。說明小鼠后肢皮下荷瘤26 d后腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，重塑淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成，最終形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。同時(shí)該模型操作簡單，成瘤率為100%，重復(fù)性好，但發(fā)生轉(zhuǎn)移的時(shí)間較長，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
后腳掌-腘窩淋巴結(jié)模型
取4T1細(xì)胞懸液50 μL，含5×105個(gè)細(xì)胞，使用一次性無菌胰島素注射針皮下接種于BALB/c小鼠左后肢腳掌。結(jié)果顯示在腘窩處的淋巴結(jié)中出現(xiàn)了2處成片的腫瘤亮區(qū)，說明腫瘤細(xì)胞在淋巴結(jié)內(nèi)形成了2處轉(zhuǎn)移灶。該部位的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，說明轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞形態(tài)差異大，雖然沒有形成腺體樣結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞表面成泡狀，與正常淋巴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)完全不同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)前哨淋巴結(jié)（SLN）質(zhì)量較對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）質(zhì)量顯著增加。這也證明通過腳掌荷瘤建立向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小鼠模型是可行的。
舌下-頸內(nèi)靜脈肩胛舌骨肌淋巴結(jié)模型
用鑷子將麻醉后的BALB/c小鼠舌頭固定，取4T1細(xì)胞懸液50 μL，含5×105個(gè)細(xì)胞，使用一次性無菌胰島素注射針接種于BALB/c小鼠舌左緣黏膜下。根據(jù)病理切片的結(jié)果顯示，小鼠淋巴結(jié)正常形態(tài)存在，無腫瘤細(xì)胞侵襲。同時(shí)荷瘤小鼠的前哨淋巴結(jié)（SLN）與正常小鼠淋巴結(jié)（Control）質(zhì)量無明顯變化。該荷瘤模型成瘤后易引起小鼠進(jìn)食困難，從而導(dǎo)致小鼠消瘦，在荷瘤的第9天造成小鼠死亡，存活時(shí)間短不利于后續(xù)其他實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
骨髓內(nèi)-腹股溝淋巴結(jié)模型
取 4T1細(xì)胞懸液8 μL，含5×105個(gè)細(xì)胞，使用一次性無菌胰島素注射針接種于麻醉后的BALB/c小鼠后肢腿脛骨中。結(jié)果顯示小鼠腹股溝淋巴結(jié)未發(fā)生變化，其結(jié)構(gòu)完整，濾泡分布均勻。前哨淋巴結(jié)（SLN）與對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）質(zhì)量無明顯變化，說明此種方法在構(gòu)建淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移小鼠模型上不易成功。該種方法的成瘤率為70%，較其他荷瘤方式成瘤率低。
右上背皮-腋窩淋巴結(jié)模型
取4T1細(xì)胞懸液100 μL，含5×105個(gè)細(xì)胞，使用一次性無菌胰島素注射針皮下接種于BALB/c小鼠右上背皮下。結(jié)果顯示小鼠腋窩處淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，淋巴細(xì)胞未發(fā)生變化，同時(shí)前哨淋巴結(jié)（SLN）的質(zhì)量與對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）相比未發(fā)生顯著變化。此荷瘤方式簡單，成瘤率可達(dá)100%，但腫瘤細(xì)胞向腋窩淋巴結(jié)的侵襲較緩慢，在荷瘤后17 d依然未見淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)、形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞間質(zhì)也未見明顯變化。
乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的生命健康，2022年美國新增287 850例侵襲性乳腺癌，其中因乳腺癌而死亡的患者約43 250例。乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移與否決定了患者的治療方法及預(yù)后情況，但目前對于乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未明確，而乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位便是腋窩淋巴結(jié)。為深入了解乳腺癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移機(jī)制，目前急需建立穩(wěn)定、高效、易重復(fù)的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。
腫瘤轉(zhuǎn)移模型主要包括自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型、移植性腫瘤轉(zhuǎn)移模型和誘發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型。其中誘發(fā)性轉(zhuǎn)移模型的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移率較低；移植性腫瘤轉(zhuǎn)移模型雖然發(fā)生轉(zhuǎn)移率高、方法簡單，但是其對手術(shù)無菌操作要求嚴(yán)格且成瘤周期較長，更重要的是個(gè)體差異較大，不適用于所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因此，在本實(shí)驗(yàn)中主要選擇了自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行研究。在所采用的7種荷瘤模型中，PyMT小鼠自發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為100%,可形成巢樣乳腺組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)其自發(fā)成瘤導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床患者的現(xiàn)象更加吻合，直接選用PyMT小鼠就能滿足實(shí)驗(yàn)要求，無需其他實(shí)驗(yàn)操作，但選擇該模型進(jìn)行研究時(shí)耗費(fèi)的成本遠(yuǎn)高于其他自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型，同時(shí)該模型用于研究腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)腫瘤負(fù)荷較大，且可能形成多個(gè)腫瘤，不利于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
Source: 陸軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2024, 46 （16），乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)，DOI: 10.16016/j.2097-0927.202312031
17312606166