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摘要：近年來，斑馬魚已成為心血管研究的強(qiáng)有力的脊椎動物模型。它的優(yōu)點包括易于遺傳操作、透明、體積小、成本低，以及在發(fā)育早期無活躍循環(huán)的情況下生存的能力。對整個基因組進(jìn)行測序，并用人類基因組識別正位基因，使得通過遺傳途徑誘導(dǎo)臨床相關(guān)的心血管缺陷成為可能。對于這些疾病模型，需要以可靠的方式評估心臟功能和受干擾的血流動力學(xué)，以揭示誘導(dǎo)缺陷的機(jī)械力學(xué)生物學(xué)。這項工作需要精確測定發(fā)育中心臟內(nèi)的血流模式和血流動力學(xué)應(yīng)力（即壁剪切應(yīng)力和壓力）水平。傳統(tǒng)的方法是利用延時的明視野顯微鏡來跟蹤細(xì)胞和組織的運動，但在最近的研究中，快速的光片熒光顯微鏡被用于這一目的。將更復(fù)雜的技術(shù)如粒子圖像測速和計算流體動力學(xué)模型相結(jié)合用于血流動力學(xué)分析，有助于斑馬魚的研究。我們討論了斑馬魚胚胎心臟功能和血流動力學(xué)分析的最新進(jìn)展，并總結(jié)了我們對斑馬魚心血管系統(tǒng)動力學(xué)分析的未來展望。

簡介：小鼠是已建立的哺乳動物心血管研究模型。敲除小鼠模型使研究許多先天性心臟缺陷（CHD）類型成為可能。胚胎雞是一種常用的脊椎動物模型，具有類似于人的心臟結(jié)構(gòu)的優(yōu)點，具有四腔/四瓣結(jié)構(gòu)，能夠進(jìn)行臨床相關(guān)的手術(shù)操作。胚胎斑馬魚最近出現(xiàn)在心血管研究中，用于高通量研究。盡管斑馬魚心臟與人類心臟不同，只是系統(tǒng)循環(huán)，但兩者的心臟結(jié)構(gòu)和生理學(xué)是相似的。斑馬魚胚胎的獨特特性使其對心血管研究特別有吸引力。例如，有一些實用的遺傳干擾方法，如嗎啡寡聚核苷酸注射，以誘導(dǎo)斑馬魚心臟缺陷。這些胚胎是透明的，可以在心臟發(fā)育過程中無創(chuàng)成像。在體內(nèi)，心腔和血管以及血流可以很容易地被觀察到。在發(fā)育早期，斑馬魚胚胎不依賴于循環(huán)系統(tǒng)，因為被動擴(kuò)散足以供氧。因此，具有嚴(yán)重心臟缺陷的胚胎能夠在早期發(fā)育中存活，通過這種方法，我們研究了無血流情況下心臟瓣膜的發(fā)育情況，這些研究證明了血流動力學(xué)對心臟瓣膜發(fā)育的重要影響。隨著正向和反向遺傳學(xué)方法的進(jìn)步，現(xiàn)在有可能在斑馬魚胚胎中誘導(dǎo)各種臨床相關(guān)的心臟缺陷。在這些動物模型中，需要對血流動力學(xué)進(jìn)行分析，以研究誘導(dǎo)缺陷的機(jī)械生物學(xué)機(jī)制。對于定性和定量的血流動力學(xué)分析，有多種顯微成像和計算建模方法。這些分析包括確定流型、測量流速、計算心功能參數(shù)和計算血流動力學(xué)應(yīng)力水平。

斑馬魚心臟發(fā)育：在脊椎動物胚胎中形成并開始運作的第一個器官是心臟。與雙心室哺乳動物心臟不同，成年斑馬魚心臟由一個心室、一個心房、一個房室（AV）瓣膜和一個流出瓣膜組成。脊椎動物之間的遺傳途徑是保守的，斑馬魚的心臟發(fā)育過程與其他脊椎動物相似。最早于前外側(cè)板中胚層受精后5小時（hpf）的心前細(xì)胞開始，并繼續(xù)形成原腸，再形成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層。原腸形成在10 hpf時完成，隨后在16 hpf時胚胎中線處的雙側(cè)心臟融合。這就形成了一個心錐，然后向前延伸，變成一個線性的心管。線性心導(dǎo)管的外層由收縮肌細(xì)胞組成，而內(nèi)層由心內(nèi)膜細(xì)胞組成。這兩層由一層無細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)層（稱為心凍）隔開。在其形成后，24 hpf時線性心導(dǎo)管開始有節(jié)奏地蠕動收縮。人類的第一次心跳開始于3周，小鼠的第一次心跳開始于（e是胚胎發(fā)育日）e8.5，雞的第一次心跳開始于（hh是雞發(fā)育期）hh10。隨后階段斑馬魚胚胎的收縮程度可通過高速延時視頻顯微鏡進(jìn)行量化，以確定心室部分縮短，這是舒張和收縮時心室尺寸的比較。即使在這個階段沒有瓣膜存在，血液仍以250μm/sec的峰值速度泵出，沒有明顯的回流。不久后，管腔開始開放，每博輸出量和心跳迅速上升。在28 hpf時，心跳正常，頻率為2.6 Hz。心臟管在33 hpf處呈S形向左轉(zhuǎn)，心室移到心房右側(cè)。在36 hpf時，泵送機(jī)制從緩慢的蠕動波轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)的心室收縮，提示心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的開始。受精后2天，心室室膨脹，內(nèi)外彎曲明顯。在此階段，心肌細(xì)胞開始從心室壁分層，開始形成小梁，到72 hpf時心室有明顯的小梁脊。小梁心肌隨著心肌壁的顯著重塑，以及致密心肌的增殖和傳導(dǎo)系統(tǒng)的成熟而向心室腔擴(kuò)張。遺傳學(xué)篩選研究揭示了斑馬魚這些早期事件的分子調(diào)控。與NKx2.5相關(guān)的GATA因子通過限制Wnt信號來控制心肌細(xì)胞祖細(xì)胞的遷移和心臟的調(diào)節(jié)。Hand2在心臟分化和形態(tài)發(fā)生中起作用，而Nkx2.5維持了心臟室的特性。最近，心臟收縮和由此產(chǎn)生的液體力量被證明能夠激活Notch信號來調(diào)節(jié)斑馬魚的心臟小梁。由小葉組成的心臟瓣膜確保斑馬魚單向血流。房室之間的房室管內(nèi)有一個瓣膜，心室和球動脈之間的流出道內(nèi)有一個瓣膜。房室瓣膜發(fā)育始于心肌中BMP4、TBX2b和VCANA的表達(dá)，以及37 hpf時Notch1b、Has2和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的心內(nèi)膜表達(dá)。血流動力學(xué)是斑馬魚AV瓣膜發(fā)育的重要機(jī)械刺激。例如，KLF2A的表達(dá)依賴于反向流動的存在，而剪切應(yīng)力控制著AV管中MIR-21的差異表達(dá)。在40 hpf時，心內(nèi)膜墊開始轉(zhuǎn)變?yōu)樵及耆~。心內(nèi)膜墊重塑為原始瓣葉，以防止76 hpf時完全逆行。此時通過心內(nèi)膜墊的血流速度約為3.0毫米/秒，最大壁面剪應(yīng)力（wss）為70dynes/平方厘米。心內(nèi)膜墊的形成發(fā)生在人類4.5周、小鼠e12周和雞hh24周。在流出血管中，動脈球由一層厚的外層平滑肌細(xì)胞和一層薄的內(nèi)層內(nèi)皮細(xì)胞組成。這個小腔體是有彈性的，可以保證高壓的保持，防止主動脈回流。與三葉哺乳動物主動脈瓣相比，流出瓣只有兩個瓣葉。斑馬魚心臟的流量可以通過簡單的追蹤單個紅細(xì)胞來測量?；蛘?，為了進(jìn)行更詳細(xì)的流量分析，數(shù)字粒子圖像測速（DPIV）可以通過連續(xù)幀之間的粒子位置相關(guān)性（在大多數(shù)情況下為紅細(xì)胞熒光）生成空間流量圖。這兩種技術(shù)都需要至少每秒150幀（fps）的快速圖像采集。紅細(xì)胞或血漿應(yīng)熒光標(biāo)記以增強(qiáng)對比度。

斑馬魚的遺傳途徑：盡管胚胎雞在外科/機(jī)械干擾研究中被廣泛應(yīng)用，斑馬魚胚胎卻適合于遺傳干擾。已知斑馬魚基因組序列，成功地將正向/反向遺傳方法應(yīng)用于斑馬魚胚胎，以確定研究特定基因功能的分子途徑。正向遺傳學(xué)是決定一個有機(jī)體特定表型的遺傳基礎(chǔ)。另一方面，逆向遺傳學(xué)是有選擇地操縱一個先前確定的基因，并分析這種操縱對生物體的影響。對于斑馬魚，通過輻射或化學(xué)處理成功地誘導(dǎo)了基于正向遺傳學(xué)的隨機(jī)突變，并為雜交后代產(chǎn)生了穩(wěn)定的系。用這種方法產(chǎn)生了數(shù)百個心血管發(fā)育異常的突變體。舉例來說，通過正向遺傳學(xué)篩選確定了導(dǎo)致瓣膜缺陷和主動脈縮窄的幾個突變。正向遺傳學(xué)的另一個例子是雙突變系casper。這種突變體沒有黑色素細(xì)胞和虹膜細(xì)胞，這使得它在整個生命中都是透明的，能夠進(jìn)行無創(chuàng)成像。斑馬魚胚胎也可以利用幾種反向遺傳技術(shù)選擇性地抑制基因功能。最常用的技術(shù)是將反義嗎啉寡核苷酸（mos）注入受精卵。mos可以通過靶向轉(zhuǎn)錄起始位點或靶向剪接連接并誘導(dǎo)異常剪接來抑制翻譯。有效阻止靶基因的蛋白質(zhì)合成3-5天。由于在斑馬魚中易于利用，mos使基因功能的分析得以廣泛應(yīng)用。很快就發(fā)現(xiàn)一些mos工作得很好，并且有許多mos表型有效地重演突變表型，而沒有任何主要副作用。然而，mos可以誘導(dǎo)p53依賴性細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)中的非靶向細(xì)胞特異性效應(yīng)，這可能影響表型分析。在大量的基因敲除系中，在相應(yīng)的突變體中，幾乎80%的Mo變形體表型沒有被觀察到，這導(dǎo)致人們質(zhì)疑Mo在斑馬魚研究中的廣泛應(yīng)用。有人建議不應(yīng)過量注射mos以限制靶向效應(yīng)，必須產(chǎn)生穩(wěn)定的突變體并對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋碚?，以驗證mo變形劑的表型。斑馬魚最近引進(jìn)了兩種反向遺傳學(xué)的替代技術(shù)：TALENs和CRISPR/CAS9。這些技術(shù)影響基因組DNA而不是RNA轉(zhuǎn)錄。因此，它們的分子效應(yīng)可以在單胚胎水平上確定，以獲得明確的表型/基因型相關(guān)性。這些技術(shù)的非目標(biāo)效應(yīng)可以忽略不計。這些基因方法被用來在斑馬魚胚胎中產(chǎn)生人類心血管疾病，以揭示分子機(jī)制。有兩種常見的形式：擴(kuò)張型心肌病和肥厚型心肌病。對心肌病斑馬魚突變體的正向遺傳篩選顯示，titin、層粘連蛋白α4和整合素連接激酶的突變可導(dǎo)致模擬人類臨床條件的心力衰竭。在一項反向遺傳研究中，在鑒定了DCM患者的Eya4突變后，斑馬魚的Eya4基因通過嗎啡寡聚核苷酸注射被敲除。由此產(chǎn)生的表型具有心肌病，表明在這種情況下Eya4突變的作用。我們的研究小組在肥厚型心肌病患者中發(fā)現(xiàn)了肌球蛋白結(jié)合蛋白C的幾個突變，并通過嗎啡寡聚核苷酸注射對斑馬魚模型中的這些突變進(jìn)行了概括。心臟功能分析和血流動力學(xué)評估在這些和類似的動物缺陷模型中很重要。下面，我們將解釋這些斑馬魚胚胎的分析技術(shù)。

明視野延時圖像序列的心臟功能分析：在斑馬魚發(fā)育的早期階段（3-4 dpf），胚胎是透明的，內(nèi)部器官包括心臟和血液循環(huán)都有良好的可視性。因此，在這一階段，視頻明視野顯微鏡可用于心臟功能和形態(tài)的定量分析。該方法是基于記錄二維（2D）圖像序列以進(jìn)一步進(jìn)行心血管分析。動物處于側(cè)位，整個心臟周期內(nèi)心室清晰可見。在此配置中，中庭不可見。使用自動視頻邊緣檢測系統(tǒng)可以測量心室功能的心肌壁。120-fps視頻捕獲速度足以滿足此應(yīng)用。收縮壁速度水平在2 dpf時約為200μm/sec，在6 dpf時約為275μm/sec。心室壁運動也可以用類似于M型超聲心動圖的方法進(jìn)行實際分析。這里的目的是在整個心臟周期中跟蹤心室壁位置的連續(xù)變化。通過首先確定感興趣的線性區(qū)域來實現(xiàn)。這個區(qū)域要么是心室的短軸，要么是心室的長軸。對于M模式圖像，沿這條線的強(qiáng)度值是Y軸，視頻的每一幀在X軸中表示。這樣，心室短軸和長軸直徑的變化可以在整個心臟循環(huán)中測量。M型分析可以跟蹤心肌壁厚和心室直徑。舒張和收縮的短軸直徑表示為dd和ds，心肌厚度表示為mtd和mts。圖像以250 fps的速度捕獲，以獲得良好的時間分辨率。測量血流速度以量化斑馬魚胚胎的心血管功能。這可以通過簡單地跟蹤胚胎體內(nèi)紅細(xì)胞（RBC）的運動來實現(xiàn)，紅細(xì)胞由于透明的皮膚很容易被識別出來?？梢杂嬎慵t細(xì)胞運動的加速、減速和峰值速度進(jìn)行分析。紅細(xì)胞在兩條通過身體的主血管中的運動，在主動脈背側(cè)和主靜脈中，可以成像。

通過光片熒光顯微鏡進(jìn)行三維實時成像：斑馬魚胚胎心臟的高分辨率成像要求很高，因為其心率為2-4赫茲，相對較大的尺寸約為250μm。因此，斑馬魚心血管系統(tǒng)的體內(nèi)功能和結(jié)構(gòu)成像需要先進(jìn)的顯微鏡，該顯微鏡可以記錄高時間和空間R值的光學(xué)切片。傳統(tǒng)的共焦激光掃描熒光顯微鏡（CLSM）是基于物體的點掃描。穿透深度也相對較低；因此，捕獲跳動的斑馬魚胚胎心臟是很困難的，尤其是對于較老的胚胎。光片熒光顯微鏡（LSFM）于2004年推出，以消除CLSM的局限性。這種技術(shù)被稱為選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）。其工作原理是利用薄激光片從側(cè)面照射熒光標(biāo)記的樣品,僅在檢測目標(biāo)的焦平面激發(fā)熒光，同時記錄發(fā)射光.LSFM中的檢測系統(tǒng)包括CCD/SCMOS攝像機(jī)，而不是像CLSM中那樣的掃描光電倍增管探測器。因此，LSFM提供了幾個重要的優(yōu)點，包括提高采集速度、高信噪比、低光漂白和大穿透深度。此外，在大多數(shù)應(yīng)用中，樣品被放置在一個專用的垂直支架（透明注射器或毛細(xì)管）中，并浸入一個充滿介質(zhì)的成像室中。將樣品嵌入低濃度瓊脂糖柱中，與傳統(tǒng)的玻璃載玻片相比，低濃度瓊脂糖柱對活的生物樣品來說壓力更小。垂直安裝還可以在不變形的情況下旋轉(zhuǎn)精密樣品，并方便360°成像。因此，LSFM成為斑馬魚研究的新標(biāo)準(zhǔn)成像方式，因為它能夠在生理成像介質(zhì)中實現(xiàn)快速和高分辨率的動態(tài)成像。LSFM顯著增強(qiáng)了斑馬魚胚胎的心功能分析。心臟內(nèi)的特定區(qū)域現(xiàn)在可以在體內(nèi)高分辨率成像。然而，為了對心臟進(jìn)行完整和準(zhǔn)確的功能分析，需要對三維重建的心臟跳動圖像進(jìn)行三維分析。心臟在所有維度上持續(xù)快速的運動，使得捕捉這樣高分辨率的圖像變得非常困難。一種解決辦法是像沉默的心臟模型那樣抑制心臟。然而，該模型不適用于研究心臟發(fā)育過程中的血流動力學(xué)和心臟收縮。另一種方法是使用前瞻性門控技術(shù)獲得靜止的3D心臟。當(dāng)心臟繼續(xù)跳動時，它會在成像物鏡的焦平面上緩慢移動。對這些圖像進(jìn)行三維重建，以在這個特定階段生成心臟模型。不能用這種方法研究心跳的動力學(xué)。心臟跳動的動力學(xué)只能通過4D成像（3d+時間）進(jìn)行全面分析，這需要非?？焖俚膱D像采集和深度穿透。采集后同步技術(shù)的進(jìn)步使得在4D中捕捉斑馬魚胚胎心臟跳動的動態(tài)成為可能。?在這項技術(shù)中，心臟組織的動態(tài)運動是通過對圖像疊加的回顧性時間配準(zhǔn)來重建的。在整個心臟深度的連續(xù)光學(xué)截面上，記錄下跳動的心臟的短片。然后，對連續(xù)z平面的圖像序列進(jìn)行回顧性登記，以制作心臟跳動的4D影片。心包細(xì)胞、心肌細(xì)胞和紅細(xì)胞可以被熒光染色，以70–85 fps的速度錄制的3D電影可以用于制作4D電影，實現(xiàn)詳細(xì)和動態(tài)的心臟功能分析。最近，雙光子激發(fā)與LSFM的集成導(dǎo)致穿透深度的增強(qiáng)和光板厚度的保留，從而實現(xiàn)了高采集速度（>70 fps）和低光損傷。為進(jìn)一步提高掃描速度，已開發(fā)出新的方法。一種是多色LSFM。實現(xiàn)混合波長激發(fā)，實現(xiàn)快速多色雙光子成像。通過這種方法，分別對CFP、GFP和DSRED標(biāo)記的心包、心肌和紅細(xì)胞進(jìn)行了模擬成像。快速時間序列圖像以每秒85幀的速度采集，然后用于生成心臟周期運動的4D電影。與單色LSFM相比，該技術(shù)沒有產(chǎn)生額外的光損傷。同時對心肌和紅細(xì)胞成像可改善動態(tài)分析。最后，圖像采集技術(shù)的進(jìn)步使4D電影能夠直接錄制心臟跳動。光片顯微鏡現(xiàn)在可以記錄心肌壁和紅細(xì)胞的動態(tài)運動；這一進(jìn)展導(dǎo)致了先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用，如粒子圖像測速和計算建模，斑馬魚心血管血流動力學(xué)分析。

基于數(shù)字粒子圖像測速（DPIV）的剪應(yīng)力分析：WSS是心血管系統(tǒng)中作用于血管壁和瓣葉表面的摩擦力。它是剪切速率（與血管半徑相關(guān)的速度導(dǎo)數(shù)）和血液動態(tài)粘度（流體粘度是其抗應(yīng)力逐漸變形能力的一種度量）的產(chǎn)物。定量和定性分析心血管系統(tǒng)中的WSS是重要的，因為它的大小和方向都被認(rèn)為有助于心臟發(fā)生。有重要證據(jù)表明，心血管內(nèi)皮細(xì)胞上的WSS可顯著影響血管和瓣膜的發(fā)育，以及成人有機(jī)體血管和瓣膜疾病的發(fā)病機(jī)制。具有不同流體力學(xué)特性（即穩(wěn)定與不穩(wěn)定、層流與湍流、順行與振蕩）的流動顯示出對內(nèi)皮細(xì)胞中特定基因表達(dá)途徑的不同調(diào)節(jié)。因此，準(zhǔn)確測定剪切應(yīng)力模式和剪切應(yīng)力水平對于心血管疾病的臨床和體內(nèi)研究具有重要意義。由于WSS與容器壁的軸向速度梯度成正比，因此應(yīng)確定該位置的速度梯度來計算WSS。然而，由于以下幾個原因，這不是一項容易的任務(wù)：復(fù)雜的幾何結(jié)構(gòu)、不穩(wěn)定的脈沖流行為、移動的邊界（即血管壁和瓣膜傳單）和血液的非牛頓行為（血液粘度隨剪切速率的變化、剪切減薄特性）。因此，對于WSS計算，通常采用簡化假設(shè)，如理想幾何、穩(wěn)定流、簡單拋物線速度剖面、牛頓行為等，但這些都會導(dǎo)致不可靠的結(jié)果。DPIV已成為體內(nèi)研究確定心血管系統(tǒng)中速度向量和WSS水平的有力工具。對于像斑馬魚心血管流這樣的小幾何體，DPIV需要對流場進(jìn)行微觀分析。在這里，示蹤粒子的直徑非常重要，因此這些顆粒應(yīng)足夠大，能夠單獨識別，同時又足夠小，能夠跟隨局部流動。對于斑馬魚血流量的DPIV，可以跟蹤紅細(xì)胞或注射珠。在Hove等人的開創(chuàng)性研究中，通過追蹤紅細(xì)胞來測定速度和WSS水平。

通過計算流體動力學(xué)（CFD）進(jìn)行血流動力學(xué)分析：CFD模型在心血管研究中非常有利于研究復(fù)雜的流體行為，實驗測量只能提供有限的信息。CFD模型也被用于體內(nèi)研究，目的是研究發(fā)育中心臟的血流動力學(xué)。為此，胚胎雛雞模型得到了廣泛的應(yīng)用。斑馬魚是另一種常用于心血管研究的動物模型。以前的研究表明，與其他動物系統(tǒng)相似，機(jī)械信號有助于斑馬魚心臟的發(fā)育。更具體地說，流體剪切應(yīng)力和跨壁壓力通過觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械生物學(xué)機(jī)制來影響血管、腔和瓣膜的形態(tài)形成。通過發(fā)育中的心臟的血流受到干擾，導(dǎo)致心臟發(fā)育改變，與人類冠心病相似。然而，有趣的是，對于斑馬魚模型的詳細(xì)血流動力學(xué)研究，目前還缺乏CFD研究。在一項研究中，針對一個簡化的心臟幾何結(jié)構(gòu)（近似于4.5 dpf斑馬魚心臟）開發(fā)了一個二維CFD模型。模型是一個線性通道，兩個交錯的心室從通道的對側(cè)凸出，代表心房和心室。心內(nèi)膜墊存在于流入道、AV管和流出道的背側(cè)和腹側(cè)。?采用兩種不同的方法進(jìn)行血流模擬：第一種方法是通過剛性幾何體在入口邊界定義速度入口條件。在第二種方法中，心房和心室被定義為彈性材料，收縮的心房強(qiáng)制血流，收縮的心房彈性地伸展心室。通過求解控制流體流動方程，得到了作用于壁面和心內(nèi)膜墊上的速度流線圖和WSS值。對流線型的分析表明，應(yīng)考慮移動邊界以準(zhǔn)確捕捉流型。在剛性模型中，室壁最大法向應(yīng)力為0.02 dynes/cm2，心內(nèi)膜墊最大WSS為2 dynes/cm2。不同心內(nèi)膜墊高度的模擬顯示，這些墊的發(fā)育顯著影響心臟內(nèi)的WSS分布和大小，以及室壁壓力水平。最高的WSS位于緩沖墊上，隨著高度的增加，WSS也會增加。由于狹窄的房室通道具有更高的流動阻力，隨著墊層高度的增加，室壁上的法向壓力也顯著增加。在隨后的研究中，將斑馬魚血流動力學(xué)邊界建模方法應(yīng)用于基于真實幾何的CFD模型。采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，其中含有綠色熒光蛋白標(biāo)記的內(nèi)皮/心內(nèi)膜細(xì)胞和GATA1標(biāo)記的紅細(xì)胞。GFP標(biāo)記可以跟蹤管腔壁的邊界，而GATA1標(biāo)記可以跟蹤血流（通過DPIV），因此可以測量血流速度。斑馬魚胚胎在20-30 hpf到110-120 hpf階段被納入研究。使用熒光顯微鏡收集20 fps時胚胎心臟的二維圖像。在每幅圖像中，通過追蹤熒光內(nèi)皮細(xì)胞來確定管腔邊界。建立了一種實用的方法來估計斑馬魚心臟中的WSS水平。該方法將活體共焦成像與CFD相結(jié)合，并基于從心壁動力學(xué)（而不是直接從紅細(xì)胞運動）估算WSS水平。本研究使用48-hpf斑馬魚胚胎。在120 fps下對GATA1-DSRED標(biāo)記的RBC進(jìn)行實時成像，以生成4D心臟視圖。在這個二維幾何體上，定義了流體動力中心線，為心臟解剖提供了一維參數(shù)化。這些工作表明了計算流體動力學(xué)在斑馬魚血流動力學(xué)分析中的重要性，但為了更好地理解心臟發(fā)育的機(jī)理，還需要做更多的工作。計算機(jī)模型需要在3D中開發(fā)，并且必須結(jié)合壁動力學(xué)和流體動力學(xué)（流體-結(jié)構(gòu)相互作用方法）進(jìn)行精確分析。

結(jié)論：在過去的幾十年里，斑馬魚模型已經(jīng)發(fā)展成為一個非常強(qiáng)大的模型來研究心臟發(fā)育。正向和反向遺傳干擾技術(shù)的進(jìn)步使得在這些動物身上誘導(dǎo)人類心血管缺陷成為可能。心血管動力學(xué)已經(jīng)在這些疾病模型中進(jìn)行了研究，最常見的是通過基本的2D 明視野顯微鏡分析，該分析涉及心臟功能計算的誤差。光片熒光顯微鏡是專門為斑馬魚胚胎研制的。這些顯微鏡可以實時跟蹤心肌壁和紅細(xì)胞的運動。因此，現(xiàn)在可以用這些顯微鏡制作4D跳動的斑馬魚心臟電影。通過LSFM快速獲取圖像，使得將DPIV和計算建模等先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用于斑馬魚研究成為可能。然而，由于斑馬魚心臟小尺寸和快速移動邊界的成像和建模困難，目前大多數(shù)研究涉及二維心臟平面的血流動力學(xué)分析。開發(fā)具有不同平面同步圖像采集工作原理的三維微DPIV系統(tǒng)將有助于斑馬魚心臟在三維中的直接和快速可視化。超聲生物顯微鏡和光學(xué)相干斷層掃描系統(tǒng)已成功應(yīng)用于其他胚胎動物系統(tǒng)，以及成年斑馬魚。這些是胚胎斑馬魚成像的潛在非常有用的方式。由于體型非常小，目前的商業(yè)系統(tǒng)不適合斑馬魚胚胎。我們希望在不久的將來能開發(fā)出新的探針來成像胚胎斑馬魚。根據(jù)CFD建模，未來的模型應(yīng)基于流體-結(jié)構(gòu)相互作用方法，將壁動力學(xué)和血流動力學(xué)結(jié)合起來。整合技術(shù)來產(chǎn)生斑馬魚的缺陷模型，將為研究者打開新的視野。