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美鳳力臨床前大動物實驗中心
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膿毒癥被定義為由宿主對感染反應失調引起的危及生命的器官功能障礙。膿毒癥的發病機制非常復雜，其中膿毒癥引起的全身促炎反應是導致器官衰竭和死亡的關鍵因素之一。近年研究發現，多種腸道菌群參與膿毒癥疾病的發生和進展。嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila, AKK) 被認為是一種功能性益生菌菌株，對許多疾病的進展具有保護作用；然而，AKK是否參與膿毒癥的發病機制尚不清楚。 2023年8月，南方醫科大學基礎醫學院陳鵬、姜勇團隊、珠江醫院周宏偉團隊及中國科學技術大學段屹團隊共同在《Gut》（IF=24.5）在線發表題為“Novel tripeptide RKH derived from Akkermansia muciniphila protects against lethal sepsis”的研究論文。此研究發現AKK菌能夠產生一種新型三肽RKH，可能作為一種新的內源性TLR4拮抗劑，預防致死性膿毒癥。在成功地將其療效轉化為臨床實踐后，RKH可能作為一種新的潛在治療方法來對抗致命性膿毒癥。該研究拓展了AKK的病理生理功能，為臨床治療致死性膿毒癥提供了一種新的潛在治療方法。 圖片來源：《Gut》 （https://gut.bmj.com/content/early/2023/08/11/gutjnl-2023-329996.long） 研究材料 小鼠：雄性C57BL/6小鼠，無菌（germ free）小鼠（賽業生物提供），TLR4-/-小鼠； 豬：巴馬豬； 細胞：小鼠骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs），THP-1細胞，病人外周血誘導分化的巨噬細胞等。 研究材料 測序技術：16S-rRNA測序，2b-RAD-M測序，高通量轉錄組測序，非靶向代謝組學檢測技術； 常規實驗技術：qRT-PCR，蛋白免疫印跡，組織HE染色，ELISA，血清損傷指標檢測，流式細胞分選及分析技術，DNA凝膠電泳技術等； 其他技術：靶向定量技術，分子對接，表面等離子共振技術，酶解和熱穩定實驗，免疫共沉淀等。 技術路線 01 AKK和膿毒癥關聯的研究：膿毒癥患者和膿毒癥小鼠的腸道AKK豐度均下降，提示AKK水平與膿毒癥相關，且僅依賴于活AKK 02 AKK改善膿毒癥的有效成分分析：活AKK產生新型三肽RKH參與膿毒癥預防，RKH處理可以預防膿毒癥小鼠致命性膿毒癥的發生 03 RKH預防膿毒癥機制的挖掘：RKH通過靶向結合TLR4并阻止TLR4激活，來預防膿毒癥引起的全身炎癥而發揮作用 04 RKH治療膿毒癥的臨床轉化探索：RKH降低膿毒癥巴馬豬模型死亡率、減輕全身炎癥和器官損傷，并負向調節膿毒癥患者來源巨噬細胞的促炎活性. 研究結果 1.腸道AKK菌參與人類和小鼠膿毒癥進展 首先，研究人員對假手術和盲腸結扎穿刺法（CLP）構建的膿毒癥小鼠的糞便進行了2bRAD-M測序，以探索腸道微生物群與膿毒癥發生和發展之間的潛在聯系。 在種水平上，與假手術組相比，CLP組的糞便中AKK豐度降低（圖1 A），隨后熒光定量PCR檢測中小鼠糞便中AKK的相對豐度也驗證這一發現（圖1 B）。重要的是，與小鼠模型一致，如圖1 C所示，61份膿毒癥患者糞便樣本的AKK豐度明顯低于27份對照樣本。為了闡明AKK在膿毒癥進展中的作用，作者將高AKK和低AKK兩組人類糞便移植到受體小鼠中并進行CLP手術。有趣的是，接受高AKK豐度糞便的小鼠的存活時間往往略高于接受低AKK的小鼠（圖1 E），盡管其他細菌也可能參與膿毒癥的進展，但這些數據表明，AKK細菌至少在一定程度上發揮了保護作用。因此，腸道AKK水平可能參與膿毒癥的進展。 2.活AKK能夠保護致死性膿毒癥小鼠 接下來，為了確定AKK對膿毒癥的直接影響，作者用PBS、活AKK或死AKK處理小鼠，然后進行假手術或CLP手術。圖1 F-H提示，活AKK，而不是滅活AKK可以減輕膿毒癥引起的器官損傷和致死性。上述數據表明，AKK的保護作用可能取決于活細菌產生的生物活性物質。然后，作者評估了來自活AKK的培養上清液是否能緩解膿毒癥。圖1 I-K提示，與對照相比，自活AKK的培養上清液可以減輕膿毒癥引起的器官損傷和致死性。LPS誘導的膿毒癥模型中的數據同樣驗證了上述觀點（圖1 L-O）?？傊?，這些發現清楚地表明，活的AKK可能通過產生保護性物質，在小鼠模型中有效地挽救了致命性膿毒癥。 圖1 腸道AKK在小鼠模型中對致命性膿毒癥具有保護作用[1] 3.活AKK產生新型的三肽Arg-Lys-His（RKH） 為了進一步探索活AKK分泌的保護性物質，作者對空白培養基和活AKK培養基的培養上清液進行了非靶向代謝組學分析，發現一種新的三肽RKH在活的AKK上清液中顯著富集，并在非靶向代謝組學分析中表現出最大的倍數變化（圖2 C-D）。靶向驗證揭示RKH在活AKK培養基顯著高表達（圖2 E），且在膿毒癥病人中RKH含量顯著下降（圖2 H）。 重要的是，作者引入賽業生物提供的無菌（germ free）小鼠并對其進行AKK菌定植，發現AKK菌定植組小鼠中血漿和盲腸內容物RKH含量顯著回升（圖2 F-G）。為了探索RKH對致命性膿毒癥的潛在治療作用，在CLP手術前/ LPS注射前給小鼠服用RKH，結果提示（圖2 I-O），AKK活性產物RKH可以在小鼠模型中預防致命性膿毒癥。 圖2 活AKK產生的Arg-Lys-His（RKH）對小鼠致命性膿毒癥的保護作用[1] 4.RKH預防膿毒癥引起的系統性炎癥 就細胞因子風暴而言，系統性炎癥是膿毒癥發病期間死亡的主要因素之一。作者對Sham對照組，CLP組以及CLP+RKH處理組的小鼠腹腔灌洗液進行轉錄組學分析。結果顯示RKH處理后，與CLP組相比其中全基因表達發生改變，且其中的炎癥因子表現下降趨勢（圖3 A-B）。進一步的，研究人員發現活AKK，AKK培養上清以及RKH處理能夠明顯降低系統性炎癥反應以及腹腔巨噬細胞富集（圖3 C-G）。此外，細胞體外刺激的結果顯示RKH能夠降低LPS誘導的多種巨噬細胞促炎反應。綜上，RKH可能通過抑制膿毒癥引起的系統性炎癥發揮保護作用。 圖3 RKH預防膿毒癥引起的系統性炎癥反應[1] 5.RKH直接靶向TLR4并阻斷TLR4激活 TLRs在膿毒癥進展過程中對入侵病原體的系統反應起著重要作用。圖4 A-B提示，RKH能夠顯著抑制巨噬細胞中TLR4下游的信號轉導。作者使用FITC熒光素標記的LPS處理巨噬細胞，發現RKH能夠顯著抑制LPS的結合（圖4 C）。結合上述結果，作者猜測RKH能夠與LPS競爭性結合TLR4，并通過表面等離子共振技術（圖4 D），酶解實驗（圖4 E），熱穩定實驗（圖4 F）和分子對接技術（圖4 I）驗證了此觀點。 更重要的是，免疫沉淀（IP）實驗的數據顯示，RKH是通過抑制TLR4-MD2和TLR4-TLR4的二聚化來實現對TLR4下游信號轉導的抑制（圖4 G-H）。此外，根據分子對接結果提示的RKH結合位點進行突變的實驗結果提示TLR4上的ARG264、LEU293、ASP294和LYS362可能是RKH抑制TLR4二聚的潛在功能結合位點。最后，作者引入TLR4-/-小鼠對上述觀點進行驗證。小鼠進行CLP手術后，RKH對生存率，臟器損傷和系統性炎癥反應沒有保護作用。這些結果表明，RKH對致命性膿毒癥的保護作用，至少部分是通過抑制TLR4信號傳導而發生的。 圖4 RKH直接靶向TLR4并阻斷TLR4激活[1] 6.RKH延長膿毒癥巴馬豬模型的存活時間并減少過度炎癥和器官損傷 為了進一步擴大RKH在臨床上治療膿毒癥的潛力，作者采用了巴馬豬膿毒癥大動物模型。圖5提示，在巴馬豬膿毒癥模型中，RKH處理能夠顯著延長生存率，降低血清中多種損傷指標，緩解多臟器損傷以及減弱炎癥反應。 圖5 RKH延長膿毒癥巴馬豬模型的存活時間并減少過度炎癥和器官損傷[1] 7.RKH負調控膿毒癥患者巨噬細胞的促炎活性 最后，為了進一步評估RKH對人類免疫細胞促炎活性調節的效力，從膿毒癥患者中提取外周血單核細胞，并在體外分化為巨噬細胞。圖6 A提示，RKH能夠顯著降低巨噬細胞IL-6的mRNA水平。此外，RKH不影響膿毒癥患者淋巴細胞正常功能（包括凋亡和細胞因子產生）。 圖6 RKH負調控膿毒癥患者巨噬細胞的促炎活性[1] 
研究結論
綜上所述，該研究提供了膿毒癥發展背景下宿主-微生物群落的相互作用的新證據。作者通過揭示活AKK產生的一種新的生物活性三肽RKH，擴展了活AKK的病理生理作用。如果在未來的臨床實踐中對膿毒癥能夠發揮保護作用，尤其是對處于高炎癥狀態的患者，RKH可能是致命性膿毒癥的潛在有效治療方法。
原文檢索：
[1]Xie S, Li J, Lyu F, Xiong Q, Gu P, Chen Y, Chen M, Bao J, Zhang X, Wei R, Deng Y, Wang H, Zeng Z, Chen Z, Deng Y, Lian Z, Zhao J, Gong W, Chen Y, Liu KX, Duan Y, Jiang Y, Zhou HW, Chen P. Novel tripeptide RKH derived from Akkermansia muciniphila protects against lethal sepsis. Gut. 2023 Aug 8:gutjnl-2023-329996. doi: 10.1136/gutjnl-2023-329996. Epub ahead of print. PMID: 37553229.
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