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摘要：斑馬魚(yú)已被確定為醫(yī)學(xué)研究中最重要的模式生物之一。多項(xiàng)研究證明人類(lèi)和斑馬魚(yú)基因組之間存在高度相似性，推薦使用斑馬魚(yú)作為了解人類(lèi)遺傳疾病（包括癌癥）的模型。斑馬魚(yú)皮膚與人類(lèi)皮膚有一些相似之處表明該模式生物特別適合研究腫瘤性和炎癥性皮膚病。本文評(píng)估了斑馬魚(yú)皮膚的具體特征，并描述了斑馬魚(yú)模型在皮膚病學(xué)研究中的主要應(yīng)用。

簡(jiǎn)介：動(dòng)物模型系統(tǒng)提供了一種技術(shù)手段來(lái)進(jìn)行人類(lèi)受試者無(wú)法進(jìn)行的研究，為理解人類(lèi)生理學(xué)和病理生理學(xué)提供了寶貴的鑰匙。其不僅可以進(jìn)行更先進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究還可以發(fā)現(xiàn)治療人類(lèi)疾病的新方法。由于其與人類(lèi)眾所周知的生理和遺傳相似性，小鼠和其他哺乳動(dòng)物模型已被常規(guī)用于醫(yī)學(xué)研究。與傳統(tǒng)模型相比，其他動(dòng)物模型顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)對(duì)該領(lǐng)域的興趣有所增加。魚(yú)類(lèi)似乎是迄今為止研究的動(dòng)物模型中最有趣的非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物模型，維護(hù)成本低且允許體內(nèi)成像。Platyfish (Xiphophorus) 和 Medaka (Oryzias latipes) 已成功用作黑色素瘤模型。20世紀(jì)80年代初，Streisinger 及其同事首次引入斑馬魚(yú)模型進(jìn)行遺傳研究。

斑馬魚(yú)是小型脊椎動(dòng)物熱帶魚(yú)被用作反向和正向遺傳研究，其特點(diǎn)是維護(hù)成本低。斑馬魚(yú)被用作正向遺傳研究模型（通過(guò)觀察某種表型來(lái)識(shí)別特定基因型）。使用點(diǎn)突變進(jìn)行正向遺傳篩選既耗時(shí)又費(fèi)力。近年來(lái)越來(lái)越先進(jìn)的技術(shù)已經(jīng)克服了使用斑馬魚(yú)創(chuàng)建多種疾病模型的挑戰(zhàn)，并通過(guò)反向遺傳學(xué)（觀察已知基因型產(chǎn)生的表型）擴(kuò)大了斑馬魚(yú)研究。超過(guò) 80% 的已知人類(lèi)疾病基因包括癌基因和腫瘤抑制基因，斑馬魚(yú)都有其直系同源物。并且一些途徑也是保守的，即使是與致癌有關(guān)的途徑。所有這些特征和證據(jù)促進(jìn)了斑馬魚(yú)作為理解人類(lèi)遺傳疾病（包括癌癥）模型的使用并指出了其在體內(nèi)篩選新療法的潛力對(duì)個(gè)性化醫(yī)療時(shí)代尤為重要。盡管小鼠模型仍然是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中最常用的模型，但斑馬魚(yú)具有小鼠模型所沒(méi)有的一些優(yōu)勢(shì)和獨(dú)特特征。

斑馬魚(yú)皮膚：魚(yú)皮包括表皮、真皮和皮下組織類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的皮膚。與表皮被角質(zhì)化的死細(xì)胞外層覆蓋的哺乳動(dòng)物和陸生脊椎動(dòng)物的表皮不同，斑馬魚(yú)的皮膚表面沒(méi)有角質(zhì)層是由被粘液覆蓋的活細(xì)胞組成。此外，斑馬魚(yú)沒(méi)有哺乳動(dòng)物的皮膚附屬器，無(wú)法檢測(cè)到毛囊和皮脂腺。哺乳動(dòng)物表皮是一種組織良好的分層組織，包括從基底膜到皮膚表面的基底細(xì)胞、棘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞。 硬骨魚(yú)表皮只有三層，表層是單細(xì)胞層，其中細(xì)胞富含角蛋白絲，在死亡時(shí)不斷被替換不會(huì)產(chǎn)生角質(zhì)層。中間層由不同的細(xì)胞類(lèi)型組成，包括單細(xì)胞腺體（粘液細(xì)胞和棒狀細(xì)胞）、感覺(jué)細(xì)胞、離子細(xì)胞和未分化細(xì)胞。 基底層是一個(gè)單細(xì)胞層，通過(guò)半橋粒與基底膜相連，半橋粒將表皮與真皮緊密連接。

斑馬魚(yú)從胚胎成熟到完全發(fā)育的魚(yú)只需要幾天時(shí)間。 在受精后一天（dpf）已經(jīng)可以檢測(cè)到代表表皮和真皮層。成年斑馬魚(yú)覆蓋表皮的鱗片在30 dpf左右形成，已經(jīng)確定音猬因子途徑在其發(fā)育中起作用。膠原基質(zhì)的形成依賴(lài)于成纖維細(xì)胞，而色素的產(chǎn)生來(lái)自黑素細(xì)胞，屬于神經(jīng)嵴衍生的色素細(xì)胞系統(tǒng)。一些表皮標(biāo)記基因，包括角蛋白 1 和 5、230 kDa 大皰性類(lèi)天皰瘡抗原、plectin 和一些皮膚基底膜區(qū)（BMZ）基因，包括 IV、VII 和 XVII 型膠原蛋白，在斑馬魚(yú)皮膚的早期發(fā)育階段表達(dá)。大多數(shù)表達(dá)的I、V 和 VI人類(lèi)膠原蛋白類(lèi)型可在6 dpf斑馬魚(yú)皮膚中檢測(cè)到。與皮膚發(fā)育有關(guān)的斑馬魚(yú)基因庫(kù)與人類(lèi)皮膚有很強(qiáng)的相似性。斑馬魚(yú)的神經(jīng)嵴產(chǎn)生三種不同的色素細(xì)胞：黑素細(xì)胞、黃素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞。黑素細(xì)胞合成黑色素，類(lèi)似于脊椎動(dòng)物的黑素細(xì)胞，黃素細(xì)胞含有蝶啶色素引起黃色外觀，虹彩細(xì)胞形成有反射光的虹彩外觀。受精后約24小時(shí)，來(lái)自神經(jīng)嵴的黑素祖細(xì)胞首先在色素細(xì)胞中形成黑素小體。

圖1、斑馬魚(yú)和人類(lèi)皮膚的比較。

與哺乳動(dòng)物黑色素細(xì)胞一樣，酪氨酸蛋白激酶 KIT 在胚胎前兩天促進(jìn)黑色素細(xì)胞的初始遷移方面發(fā)揮著重要作用。在斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)發(fā)育后期，一組新的黑素細(xì)胞有助于形成斑馬魚(yú)條紋特征。

斑馬魚(yú)皮膚炎癥：皮膚對(duì)于保護(hù)魚(yú)類(lèi)免受環(huán)境應(yīng)激因素至關(guān)重要。 由于魚(yú)是變溫動(dòng)物，即使外部參數(shù)的微小變化也可能導(dǎo)致?lián)p傷和炎癥。一系列上皮細(xì)胞、常駐非免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和粘膜上皮細(xì)胞有助于啟動(dòng)和協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)。有趣的是，與人類(lèi)不同，魚(yú)沒(méi)有大量的淋巴積聚。目前尚不清楚魚(yú)皮膚的淋巴細(xì)胞存在于何處。 最可能的理論是魚(yú)類(lèi)白細(xì)胞通過(guò)粘液分泌物遷移到皮膚以響應(yīng)損傷刺激。炎癥通路在哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)中均受 NF-κB 家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，經(jīng)典的促炎細(xì)胞因子如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 在大多數(shù)硬骨魚(yú)中占主導(dǎo)地位，因此這兩種動(dòng)物的主要炎癥機(jī)制相似。中性粒細(xì)胞在啟動(dòng)哺乳動(dòng)物和斑馬魚(yú)的炎癥反應(yīng)以及炎癥的發(fā)生中起著重要作用，尤其是通過(guò) TNF-α 和 IL-1β。一旦被激活，單核細(xì)胞分化為典型的促炎巨噬細(xì)胞，作為抗原呈遞細(xì)胞發(fā)揮作用，并產(chǎn)生活性氧（ROS）、TNF-α和IL-1β。中性粒細(xì)胞活化決定了其顆粒的胞吐作用。 中性粒細(xì)胞也招募抗原呈遞細(xì)胞，例如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。雖然哺乳動(dòng)物的白細(xì)胞起源于骨髓并在淋巴結(jié)中成熟，但斑馬魚(yú)缺乏這種結(jié)構(gòu)。頭腎中有骨髓對(duì)應(yīng)物，作為主要的造血和淋巴器官。事實(shí)上，魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物共享胸腺、脾臟和粘膜相關(guān)淋巴組織（MALT）。利用熒光研究了斑馬魚(yú)皮膚中免疫細(xì)胞的遷移和增殖，誘導(dǎo)了與炎癥相關(guān)的皮膚基因的熒光早期表達(dá)。

斑馬魚(yú)腫瘤模型：腫瘤學(xué)領(lǐng)域的最大障礙之一是解決個(gè)體間差異或腫瘤內(nèi)環(huán)境中的癌癥異質(zhì)性。癌癥研究的創(chuàng)新很大程度上得益于在活體動(dòng)物中進(jìn)一步探索這些過(guò)程。通過(guò)大規(guī)模藥物（小分子）篩選，患者來(lái)源的癌細(xì)胞異種移植 (PDX) 可以幫助克服腫瘤細(xì)胞增加的突變而導(dǎo)致的治療耐藥性。這一過(guò)程在小鼠模型中不像魚(yú)類(lèi)等非哺乳動(dòng)物模型那樣容易實(shí)現(xiàn)因?yàn)樾∈驪DX需要受體免疫抑制。與人類(lèi)相比，斑馬魚(yú)的癌癥信號(hào)通路高度保守。斑馬魚(yú)是一種多功能模型，因?yàn)榭梢栽谔囟ɑ蛑胁僮魍蛔儯瑥亩a(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因，或產(chǎn)生特定基因的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)或下調(diào)。 斑馬魚(yú)也可以進(jìn)行正向和反向遺傳篩選。斑馬魚(yú)已被用于正向遺傳篩選，以測(cè)試誘變劑對(duì)腫瘤發(fā)育的影響。導(dǎo)致 tp53 突變的乙基亞硝基脲篩選是癌癥發(fā)病機(jī)制研究中最多的基因之一，是斑馬魚(yú)在腫瘤學(xué)領(lǐng)域的首批實(shí)驗(yàn)之一。隨后引入了進(jìn)一步的技術(shù)，這有助于斑馬魚(yú)的癌癥研究取得進(jìn)展。目的是創(chuàng)建功能喪失表型或?qū)⑼ǔＴ谌祟?lèi)癌癥中發(fā)生突變的轉(zhuǎn)基因引入魚(yú)類(lèi)模型。許多突變的腫瘤抑制基因，如Tp53，以及癌基因，如mMyc和KRas，可以在斑馬魚(yú)中產(chǎn)生與在人類(lèi)身上觀察到的相同的平行腫瘤。揭示了人和魚(yú)之間腫瘤發(fā)生驅(qū)動(dòng)因素和途徑的進(jìn)化保守性。斑馬魚(yú)最常用的基因操縱技術(shù)是MOs、ZFN、TALENs和CRISPR。最近引入了新的有前途的技術(shù)用于斑馬魚(yú)，例如 TEAZ（成年斑馬魚(yú)的轉(zhuǎn)基因電穿孔）和腫瘤細(xì)胞移植，特別是 PDX 的形式。

斑馬魚(yú)黑色素瘤模型：自首次描述 BRAF V600E 模型以來(lái)，黑色素瘤無(wú)疑是斑馬魚(yú)中研究最多的癌癥和分析最多的皮膚癌之一。 在大約 43-50% 的黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)V600E 突變，一種關(guān)鍵的黑色素瘤驅(qū)動(dòng)因子也經(jīng)常在不會(huì)進(jìn)展為癌癥的良性痣和痣中發(fā)現(xiàn)。腫瘤抑制基因p53（p53?/?）的功能喪失是痣進(jìn)展為癌癥所必需的。攜帶 BRAF V600E 和 p53-/- 突變的斑馬魚(yú)黑色素瘤形成時(shí)間長(zhǎng)且罕見(jiàn)，這意味著還有其他分子改變和途徑在黑色素瘤形成中起作用。基于斑馬魚(yú)黑色素瘤中表達(dá)了通常僅限于發(fā)育中斑馬魚(yú)胚胎中的神經(jīng)嵴祖細(xì)胞的crestin，進(jìn)行了在crestin控制下表達(dá)GFP（綠色熒光蛋白）的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的研究。GFP 陽(yáng)性細(xì)胞表明，只有重新激活 crestin 的單個(gè)黑色素細(xì)胞才能引發(fā)黑色素瘤。與crestin表達(dá)一致的是SOX10轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，SOX10是一種保守的早期神經(jīng)嵴標(biāo)記，有助于黑素細(xì)胞重新編程到胚胎狀態(tài)。神經(jīng)嵴基因如 crestin（在斑馬魚(yú)黑色素瘤中）和 SOX10（在斑馬魚(yú)以及人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞系中）的重新激活可能是組蛋白表觀遺傳修飾的結(jié)果。N-RAS 突變也在斑馬魚(yú)中進(jìn)行了研究，其表達(dá)導(dǎo)致斑馬魚(yú)全身色素沉著過(guò)度。當(dāng) p53 突變被添加到突變的 N-RAS 中時(shí)，魚(yú)會(huì)產(chǎn)生侵襲性黑色素瘤，這些黑色素瘤在組織學(xué)和遺傳上與人類(lèi)黑色素瘤相關(guān)。雖然黑色素瘤的發(fā)生率低于前面提到的 BRAF 和 N-RAS 突變，但 H-RAS 突變的斑馬魚(yú)模型也顯示出黑色素瘤的發(fā)展。

斑馬魚(yú)鱗狀細(xì)胞癌模型：盡管與黑色素瘤相比，魚(yú)類(lèi)中的非黑色素瘤皮膚癌不太常見(jiàn)，但斑馬魚(yú)也已被充分用作研究此類(lèi)癌癥潛在發(fā)病機(jī)制的模型。采用鱗狀細(xì)胞癌異種斑馬魚(yú)移植模型已經(jīng)確定了參與鱗狀細(xì)胞瘤（SCC）發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵分子以及可能用作SCC治療靶點(diǎn)的化合物。作為治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究的關(guān)鍵分子是酪氨酸激酶受體 Axl，它在 SCC 中高度表達(dá)。其他重要的靶點(diǎn)是 COL7A1 基因，它負(fù)責(zé)在大皰性表皮松解癥中發(fā)展侵襲性 SCC以及重組VII型膠原（hrCol7），它能夠逆轉(zhuǎn)斑馬魚(yú)模型中的SCC血管生成。另一項(xiàng)有趣的體內(nèi)異種移植模型研究分析了酪氨酸激酶盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體 2 (DDR2) 在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (HNSCC) 細(xì)胞增殖、粘附、分化和侵襲中的作用。另一種治療HNSCC的潛在化合物是海洋微生物提取物luminacin。斑馬魚(yú)胚胎的研究表明luminacin治療腫瘤細(xì)胞刺激SCC細(xì)胞系的自噬從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展。斑馬魚(yú)模型也表明KB細(xì)胞中FLOTILIN-1的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了KB細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞生長(zhǎng)。這些研究證明斑馬魚(yú)模型不僅可用于評(píng)估SCC發(fā)生和發(fā)展的分子途徑，還可用于藥物毒性和篩選試驗(yàn)。

斑馬魚(yú)的其他皮膚病學(xué)應(yīng)用：斑馬魚(yú)不僅可用于研究源自黑色素細(xì)胞的癌癥，還可以研究其他黑色素生成障礙，因?yàn)榘唏R魚(yú)和哺乳動(dòng)物之間的黑色素生成途徑是保守的。通過(guò)研究斑馬魚(yú)白化病模型可以闡明基因的功能，這些基因在這種疾病的發(fā)病機(jī)制中的作用可能尚未被認(rèn)為與人類(lèi)白化病有關(guān)。正確的基因診斷可能對(duì)治療不同但臨床上往往無(wú)法區(qū)分的白化病至關(guān)重要。基因功能的快速 CRISPR 篩選使斑馬魚(yú)成為發(fā)現(xiàn)白化病基因的絕佳模型。盡管違反直覺(jué)，斑馬魚(yú)白化模型也有助于闡明黑素瘤中癌性黑素細(xì)胞的化療耐藥機(jī)制。使用MOs研究遺傳性色素障礙以確定先前在受影響個(gè)體中鑒定的特定基因的功能。蛋白質(zhì)O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1（pofut1）和早老素增強(qiáng)子-2（psenen）敲除斑馬魚(yú)均顯示色素沉著的異常分布，從而證實(shí)上述基因參與Dowling-Degos綜合征的某些臨床表現(xiàn)。此外，還創(chuàng)建了oca2突變斑馬魚(yú)和c10orf11敲除斑馬魚(yú)以在體內(nèi)探索眼皮膚白化病相關(guān)基因功能，確認(rèn)涉及整個(gè)魚(yú)類(lèi)、小鼠和人類(lèi)的保守基因功能。

圖2、斑馬魚(yú)在皮膚生物學(xué)中的應(yīng)用

結(jié)論：炎癥性和腫瘤性皮膚病非常常見(jiàn)，并且在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。斑馬魚(yú)可以作為合適的動(dòng)物模型以擴(kuò)大我們對(duì)皮膚疾病的分子和細(xì)胞機(jī)制的理解并在皮膚病學(xué)中開(kāi)發(fā)新的治療策略。由于其低維護(hù)成本、高度保守的基因組和易于遺傳操作，斑馬魚(yú)是皮膚科實(shí)驗(yàn)室臨床前研究的優(yōu)秀模型，填補(bǔ)了體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)哺乳動(dòng)物模型之間的空白。

原文出自：The Zebrafish model in dermatology: an update for clinicians | SpringerLink