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摘要：N-異丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）是世界范圍內普遍使用的抗氧化劑，是輪胎橡膠中的添加劑，容易排放到周圍環境中。目前，尚未有關于IPPD對魚類亞急性毒性的研究。使用斑馬魚胚胎（受精后2小時）暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200 mg/L的濃度的IPPD 5天以研究其對胚胎發育、生長激素/胰島素樣生長因子（GH/IGF）和下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸的破壞的毒性效應。結果表明，IPPD暴露降低了斑馬魚的孵化率，削弱了運動能力，減少體長，并導致斑馬魚胚胎出現多種畸形。斑馬魚幼體暴露于IPPD后，GH/IGF和HPT軸相關基因的表達發生改變。同時，IPPD顯著降低了仔魚體內甲狀腺素（T4）和3,5,3′-三碘甲狀腺原氨酸（T3）的含量，表明HPT軸處于紊亂狀態。此外，IPPD 的治療降低了超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化氫酶 (CAT) 的酶活性以及谷胱甘肽 (GSH) 的水平。而暴露于IPPD后丙二醛（MDA）的含量升高。本研究表明，IPPD誘導氧化應激，引起發育毒性，并破壞斑馬魚的GH/IGF和HPT軸，這可能導致發育障礙和生長抑制。

關鍵詞：斑馬魚  IPPD  生長激素/胰島素樣生長因子（GH/IGF）軸  下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸  氧化應激

簡介：橡膠抗氧劑是添加到橡膠及其制品中的一種添加劑，具有抑制氧化、耐熱或耐光、防止老化的作用，從而延長制品的貯存期和使用壽命。由于輪胎的磨損，這些抗氧化劑及其化合物很容易隨路面雨水釋放到水體中。相關研究報告稱，當銀鮭向上游遷徙并產卵時，每年有90%的鮭魚突然死亡。如果碰巧遇到大雨，它會加快鮭魚的死亡時間，大量鮭魚將在短短幾個小時內死亡。研究人員認為，這與輪胎生產過程中添加的抗氧劑6PPD產生的化合物N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-對苯二胺(6PPD)-醌密切相關。根據不同的標準，橡膠抗氧劑可以分為不同的種類，其中芳香族仲胺（Ar-SAs）是最常用的一種。就化學結構的變化而言，Ar SA可分為取代二苯胺（S-DPAs）和取代對苯二胺（S-PPD）。后者是橡膠工業中最有效和最常用的抗氧化劑和抗臭氧劑。N-異丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）和6PPD都是抗氧化劑的芳香族仲胺（Ar-SAs），也是使用最廣泛的輪胎抗氧化劑。橡膠釋放到廢水中是非常令人擔憂的，因為水載污染物會影響人類和動物的健康以及我們的自然生態系統。IPPD用作橡膠中的抗氧化劑，主要用于汽車輪胎，世界上IPPD的年產量為10000–15000噸。IPPD 的 log 辛醇-水分配系數 (log Kow) 值為 3.88，在2～16h的不同純度水中測定了IPPD的半衰期值。很少有研究關注IPPD的毒性，其在環境中的水平尚不清楚。迄今為止，有關 IPPD 毒性的信息很少見。 沒有關于人類急性吸入或口服暴露IPPD后影響的數據。在兩項簡要報告的研究中，大鼠經口IPPD途徑具有中等毒性，而家兔經皮途徑具有極低毒性。IPPD是動物和人類的皮膚致敏劑。體外哺乳動物細胞誘變試驗表明，IPPD具有誘發染色體畸變的潛力。根據急性毒性結果，虹鱒魚和黑頭鰷魚的 96 h 致死濃度 50 (LC50) 為 0.34 至 0.43 mg/L。并且沒有關于 IPPD 對魚類的亞急性影響的信息。 IPPD是否對水生生物有明顯的發育毒性尚不清楚。雖然生長和發育是復雜的遺傳和分子相互作用的結果，因此是各種因素的組合，但魚類的幾乎所有主要生理過程，包括能量平衡、免疫功能、繁殖以及主要生長，都受生長激素和生長激素/胰島素樣生長因子（GH/IGF）軸的調節。因此，生長激素/胰島素樣生長因子軸作為魚類生長的關鍵神經內分泌調節因子引起了廣泛關注。此外，甲狀腺激素（THs）在體細胞生長、發育、代謝、孵化后變態和行為控制中起著至關重要的作用。甲狀腺激素的合成、分泌、運輸和代謝受下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸的調節。眾所周知，沒有健康的生理功能，魚就無法生長。 含有抗氧化酶和非酶抗氧化劑的抗氧化防御系統對魚類的生長性能也起著重要作用。在這項研究中，斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的 IPPD 以觀察發育和生長毒性。 定量測定主要影響生長發育的GH/IGF和HPT軸所涉及的激素和基因表達的變化。并檢測到參與抗氧化防御系統的抗氧化酶。 本研究的目的是研究斑馬魚抗氧化防御系統、GH/IGF 和 HPT 軸對 IPPD 暴露的反應機制。

發育毒性：IPPD 對斑馬魚的 96 小時 LC50 為 1.2 mg/L，95% 置信區間為 0.9-1.5 mg/L，根據全球化學分類和標簽協調手冊 (GHS) 分類標準，IPPD 對斑馬魚具有劇毒。三個暴露組的孵化率均下降，0.1200 mg/L處理組的孵化率比對照組低39.76%。

圖1、暴露于 IPPD (0, 0.0012, 0.0120 和 0.1200?mg/L) 的斑馬魚（a） 48?h的孵化率、(b) 60 秒內自主運動、(c) 120?h胚胎的體長。

與對照組相比，所有 IPPD 治療組的自發運動均顯著降低，0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L 治療組的自發運動分別降低了 28.5%、31.17% 和 68.5%。暴露120?h后，0、0.0012、0.0120和0.1200?mg/L的平均體長分別為4.15（?±?0.16）、4.02（?±?0.16）、3.85（?±?0.10）和3.75（?±?0.06）mm。暴露于 0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 后觀察到顯著下降。記錄了IPPD引發斑馬魚幼體的畸形。與對照組相比，所有治療組均觀察到典型畸形，包括彎尾畸形（BT）、脊柱彎曲畸形（BS）和卵黃囊腫（VC）。此外，觀察表明，畸形可能以一種形式出現，也可能同時以多種形式出現。

GH/IGF 軸上的基因轉錄譜：暴露于IPPD后，gh的轉錄水平（1.13、1.11和1.04倍）沒有顯著變化。同樣，經IPPD處理后，ghrh的表達也沒有顯著變化。ghra 基因表達水平（0.77、0.91 和 0.57 倍）在 0.0012 和 0.1200?mg/L 處理組中下調，而 ghrb（1.68、1.58 和 1.09 倍）在 0.0012 和 0.0120?mg/L 暴露組中顯著上調。

圖 2、 斑馬魚胚胎暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 下 96?h 的 GH/IGF 軸相關基因的 mRNA 表達譜。

在三個IPPD暴露組中，igf1的表達（0.32、0.27和0.47倍）顯著下調.。同樣，在三個IPPD暴露組中，igf1ra（0.09、0.09和0.25倍）和igf1rb（0.12、0.11和0.68倍）的表達也顯著下調。igf2a（1.17、1.00和0.68倍）和igf2b（1.15、1.07和0.57倍）的轉錄水平僅在0.1200?mg/L IPPD組中下調。與 igf2a 和 igf2b 類似，igf2r 的轉錄水平（1.25、1.18 和 0.42 倍）僅在 0.1200?mg/L IPPD 組中下調。igfbp1a（0.93、0.79和0.19倍）和igfbp1b（1.27、1.18和0.22倍）的轉錄水平僅在0.1200?mg/L處理組顯著下調。在三個IPPD暴露組中，igfbp2a（0.33、0.44和0.48倍）和igfbp6b（0.58、0.42和0.28倍）的轉錄水平顯著下調。igfbp5a的基因表達（0.89、1.42和1.19倍）僅在0.0120?mg/L IPPD組中上調。 IPPD對igfbp7的表達無顯著影響（1.09、1.26和1.23倍）。

HPT軸基因轉錄譜：與對照組相比，所有暴露組的tshβ（0.69、0.59和0.53倍）和crh（0.64、0.52和0.37倍）基因均呈濃度依賴性下調。

圖 3 、斑馬魚胚胎暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L 的IPPD 96?h 時，HPT 軸相關基因的 mRNA 表達譜。暴露于 0.0012?mg/L 和 0.1200?mg/L IPPD 顯著上調 dio2 的表達（1.30、1.17 和 1.31 倍）。同樣，三個 IPPD 暴露組中，tr?α（0.54、0.49 和 0.38 倍）和 tr?β（0.55、0.46 和 0.40 倍）的表達顯著下調。

GH和IGF含量：與對照組相比，三個IPPD治療組的GH激素水平顯著降低。同樣，與對照組相比，暴露于IPPD顯著降低IGF的激素水平。仔魚暴露120小時后測量全身THs水平。 各治療組T3、T4總水平呈下降趨勢。同時，與對照組相比，所有暴露組的T3與T4比率均顯著降低。

圖4、 暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑馬魚仔魚GH（a）和IGF（b）激素水平

圖5、（a） 甲狀腺素（T4）含量；（b） 3,5,30-三碘甲狀腺原氨酸（T3）含量；（c） 暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑馬魚仔魚的T3/T4比值。

氧化應激：暴露于 IPPD 會導致 MDA 和 GSH 水平以及 SOD 和 CAT 的酶活性發生顯著變化。與對照組相比，所有治療組的SOD活性均呈劑量依賴性下調，CAT活性均顯著下調。三個治療組的MDA含量均有不同程度的升高。 而0.0012和0.0120?mg/L組GSH含量較對照組降低。

圖 6. 暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 直至 120 hpf 的斑馬魚仔魚 SOD (a)、CAT (b) 和 MDA (c)、GSH (d) 水平的變化。

討論：IPPD對生物體的毒性尚不清楚。根據幾項簡短的研究，IPPD對大鼠具有中等毒性，對家兔具有極低毒性。IPPD是動物和人類的皮膚敏化劑，有可能誘發哺乳動物細胞染色體畸變。根據魚類的急性毒性結果，IPPD對藍鰓太陽魚、虹鱒和黑頭鯉具有高度毒性。目前沒有關于IPPD對魚類亞急性影響的信息。在本研究中，我們在實驗室條件下評估了IPPD對斑馬魚胚胎-仔魚生長發育階段的影響。對孵化率和體長有顯著影響，這表明胚胎發育直接延遲。自發運動是肌肉和運動神經系統共同發育的結果，是評估化學品對魚類毒性的重要毒理學終點。我們還檢測到仔魚的自發運動減少。 因此，IPPD 暴露后自發運動的濃度依賴性減少可能意味著由于 IPPD 潛在的神經發育毒性而導致的發育遲緩。 需要進一步的調查來證實這一觀察結果。多種環境化學物質，如金屬元素、納米顆粒、持久性有機污染物、殺蟲劑，均可誘發脊柱彎曲等骨骼異常。脊柱畸形可能是由于健康肌肉骨骼系統發育所必需的肌節和/或肌球蛋白形成減少所致。在本研究中，IPPD引起的畸形可能是一種或多種機制的結果。由于確定畸形的機制不是本研究的目標，因此需要進一步的研究來調查它們。

暴露于IPPD的GH/IGF軸反應：在我們的研究中，暴露于IPPD后，仔魚的體長受到顯著抑制，這表明IPPD影響了仔魚的生長性能。生長激素/胰島素樣生長因子軸在魚類生長的內分泌調節中起主導作用。初始階段 GH/IGF 軸的任何缺陷都可能對魚類的生長產生永久性影響。 這種在脊椎動物發育早期形成的復雜生長系統主要由配體、受體和一些具有高親和力的結合蛋白組成。GH/IGF 軸由配體（胰島素樣生長因子-I、胰島素樣生長因子-II）、受體（胰島素樣生長因子-IR、胰島素樣生長因子-ⅡR）和胰島素樣生長因子結合蛋白（胰島素樣生長因子結合蛋白）組成，以協調的方式調節幾乎所有細胞類型的增殖、分化和存活。GH/IGF 軸在調節魚類的體細胞生長和孵化后發揮著至關重要的作用，被認為是環境污染物影響的指標。我們檢測了GH/IGF軸相關基因的表達。生長激素通過與肝臟中的生長激素受體 (GHR) 結合來刺激 IGF 的合成和釋放。 斑馬魚有兩種主要的 GHR（ghra 和 ghrb）。gh 的表達影響兩種特定受體（ghra 和 ghrb）的表達。gh的表達沒有明顯變化，而ghra的表達明顯下調。 因此，ghrb的表達上調，以彌補ghra的不足，維持受體的平衡。生長激素釋放激素（ghrh）是促進垂體分泌GH的最重要的神經內分泌因子。 ghrh的表達沒有顯著變化，表明ghrh可能不促進gh的表達。IGFs家族，包括IGFI和IGFII，是脊椎動物中進化上保守的肽，通過保守的信號通路發揮作用。斑馬魚基因組包含哺乳動物IGF2的兩個同源物（igf2a和igf2b）。這些IGFs參與細胞生長和代謝，IGFs的生物活性和生物利用度受IGFBPs調控。IGFBPs對IGFs的親和力高于對IGFRs的親和力。 IGFBP家族有6個成員，包括IGFBP1-IGFBP6。 哺乳動物通常有六種 IGFBP，而其他一些物種則缺乏其中的一種或多種。例如，雞和斑馬魚沒有 IGFBP 4 基因。在我們的研究中，IGFs（igf1、igf2a和igf2b）基因和IGF蛋白水平以及IGFR（igf1ra、igfrb和igf2r）的下調可能是IGFBPs（igfbp2a、igfbp1a和igfbp6b）下調的結果。IGFBPs通過影響IGF的轉運而影響IGF的正常水平和生理功能，從而導致生長發育受損。我們使用qRT PCR檢測IGFBPs（igfbp1b、igfbp2a、igfbp6b、igfbp1a、IGFBP7和igfbp5a）的表達。其中igfbp2a、igfbp6b和igfbp1a顯著下調，igfbp7和igfbp5a輕微上調。IGFBP-1是一種與IGF結合的分泌蛋白，在調節體細胞的生長、發育和衰老中起著至關重要的作用。qRT-PCR結果表明斑馬魚中igfbp1a的轉錄水平顯著下調，表明IPPD暴露后斑馬魚的生長發育受到抑制。斑馬魚IGFBP-2是一種對IGF-I和IGF-II（而非胰島素）具有高度親和力的基因編碼蛋白，在體外可抑制IGF誘導的細胞生長。本研究中觀察到的igfbp2a的顯著下調表明IPPD對斑馬魚的早期胚胎發育造成不利影響。研究表明，IGFBP6s（igfbp6a和igfbp6b）是一種抑制性蛋白質，可能通過結合IGF抑制IGF在體內的作用。在我們的研究中，igfbp6b轉錄水平的下調可能會影響IGF的正常功能。我們的結果表明，暴露于IPPD后，參與GH/IGF軸的基因表達受到干擾，這可能導致斑馬魚胚胎的生長抑制。

暴露于IPPD的HPT軸響應：在脊椎動物中，除GH/IGF軸外，HPT軸在生長發育過程中也起著重要作用，負責維持正常的甲狀腺激素濃度。HPT軸功能的改變會影響新陳代謝、滲透調節和發育。在本研究中，暴露于IPPD后，斑馬魚仔魚的全身THs（T4和T3）水平降低。我們的結果表明，暴露于IPPD可干擾體內甲狀腺激素。IPPD破壞了斑馬魚仔魚的甲狀腺系統。qRT-PCR檢測HPT軸相關基因的表達。甲狀腺濾泡中T4和T3的合成和釋放受垂體促甲狀腺激素（tsh）的控制。在哺乳動物中，促甲狀腺素釋放激素（trh）或促腎上腺皮質激素釋放激素（crh）是tsh的主要調節者，而在硬骨魚中，tsh的分泌由crh調節。因此，crh和tshβ的下調可能與甲狀腺激素含量降低有關。因此，本研究中觀察到的仔魚全身總甲狀腺激素（T4和T3）含量的降低可能是由于crh和tshβ表達下調所致。碘甲狀腺原氨酸脫碘酶 (dios) 負責甲狀腺激素的激活和失活，甲狀腺激素在脊椎動物的循環和外周 THs 水平中起著關鍵調節作用。以往的研究表明，脫碘酶的轉錄水平是暴露于環境污染物的魚類甲狀腺破裂的敏感分子生物標記物。THs在維持脊椎動物的正常生理活動中發揮著重要作用，THs與肝臟、眼睛和生殖器官等各種器官中的甲狀腺激素受體（thrα和thrβ）結合并激活，從而誘導生理活動和行為。我們的研究結果表明，在不同濃度的 IPPD 處理后，thrα 和 thrβ 的表達水平顯著下調，這可能會導致斑馬魚仔魚的生長抑制和發育障礙。氧化應激也會影響水生生物的生長、生存和發育。抗氧化防御系統由酶和非酶成分組成。 酶系統包括超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 和谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx)，而還原型谷胱甘肽 (GSH) 是重要的非酶抗氧化劑之一。SOD和CAT活性的顯著降低表明，暴露于IPPD后，斑馬魚仔魚體內活性氧（ROS）和抗氧化系統之間的平衡被破壞。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，其含量可以反映細胞器的抗氧化能力。谷胱甘肽含量的顯著降低表明抗氧化劑的過度消耗，因此導致抗氧化防御能力的顯著降低。MDA是脂質過氧化的主要氧化產物。 本研究中 MDA 生成的增加表明，暴露于 IPPD 后可誘導氧化應激。 鑒于氧化應激與生長性能之間的關系，可以推斷氧化應激是IPPD對生長的毒性作用之一。

結論：我們的研究表明，暴露于IPPD的斑馬魚胚胎表現出明顯的生長抑制，并改變了GH/IGF的激素含量以及GH/IGF和HPT軸相關基因的表達水平。我們可以推斷，IPPD 誘導的生長抑制是由 GH/IGF 和甲狀腺內分泌系統破壞的綜合作用造成的。此外，IPPD的處理顯著影響斑馬魚胚胎的抗氧化狀態，其機制需要進一步研究。鑒于IPPD作為橡膠抗氧化劑的廣泛使用，其殘留物存在于環境中，需要進一步研究，以評估IPPD單獨或與其他化學品組合使用對魚類的長期影響。

原文出自：IPPD-induced growth inhibition and its mechanism in zebrafish - ScienceDirect