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長(zhǎng)期和短期接觸碳納米顆粒 (CNP) 會(huì)影響胎兒發(fā)育和隨后的不良后果，包括早產(chǎn)、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、低出生體重、與成年期心血管、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的健康風(fēng)險(xiǎn)增加。CNPs 的不良發(fā)育結(jié)果是眾所周知的，但其潛在機(jī)制仍未知。 本研究用50、100、200μg/mL的CNPs處理斑馬魚胚胎，觀察其毒性作用。使用 RNA-seq 分析方法，我們研究了 CNP（200 μg/mL）對(duì)受精后 4 到 96 小時(shí)（hpf）暴露的斑馬魚胚胎基因表達(dá)的影響。我們觀察到CNPs處理的胚胎畸形增加，孵化減少。轉(zhuǎn)錄組分析共檢測(cè)到236個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因與光轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、類固醇和類固醇激素生物合成有關(guān)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。 我們的研究結(jié)果表明，CNPs 暴露最有可能導(dǎo)致類固醇和激素生物合成途徑中的差異基因變化，從而誘導(dǎo)發(fā)育毒性，例如斑馬魚胚胎的延遲孵化、畸形率增加和多種畸形表型。

關(guān)鍵詞：碳納米顆粒  斑馬魚胚胎  轉(zhuǎn)錄組分析  發(fā)育毒性  畸形表型

簡(jiǎn)介：黑碳（BC）存在于細(xì)顆粒和超細(xì)顆粒的大氣顆粒中，主要粒徑小于1μm，主要粒徑小于0.18μm。一些研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境空氣中的納米BC顆粒很容易進(jìn)入人體，并遷移到更深的循環(huán)系統(tǒng)中。例如，Maher等人在尸檢大腦樣本的額葉皮質(zhì)中檢測(cè)到了來(lái)自空氣污染的燃燒衍生納米顆粒。此外，在所有受試兒童的尿液中檢測(cè)到BC，總平均值（SD）為98.2×105（29.8×105）粒/毫升。在所有篩查的胎盤中都發(fā)現(xiàn)了 BC，低暴露和高暴露女性的平均 (SD) 粒子計(jì)數(shù)分別為 0.95 × 104 (0.66 × 104) 和 2.09 × 104 (0.9 × 104) /mm3 粒子。胎盤BC負(fù)荷與孕婦在妊娠期間的家庭BC暴露呈正相關(guān)。為了研究長(zhǎng)期暴露于碳納米顆粒 (CNP) 對(duì)生物體的影響，Wistar 大鼠被重復(fù)腹膜內(nèi)注射 給藥4 周。注射前，將純粉末納米粒子以 500 mg/L 的濃度懸浮在無(wú)菌鹽水溶液中。 結(jié)果表明，納米粒子在注射部位附近的腹腔內(nèi)主要以聚集體形式存在，肝臟的腸系膜和漿膜也觀察到了小的聚集體，表明納米粒子可能已經(jīng)轉(zhuǎn)移到肝臟。另一項(xiàng)研究使用雞胚模型，通過(guò)將濃度為 500 μg/mL 的實(shí)驗(yàn)溶液注射到卵白蛋白中來(lái)研究六種不同類型 CNP 的毒性。孵育5、10、15和20天后觀察大體病理學(xué)和存活率。 培養(yǎng) 20 天后，采集血樣并測(cè)量器官重量。結(jié)果表明，CNPs能降低胚胎的相對(duì)存活率，并在循環(huán)中存活，無(wú)明顯副作用，值得進(jìn)一步研究。因此，公眾越來(lái)越關(guān)注含BC的CNP的安全性，需要對(duì)這些納米大氣顆粒物進(jìn)行全面的毒性評(píng)估。

胎兒發(fā)育是暴露相關(guān)易感性的一個(gè)關(guān)鍵窗口。 成年期疾病的病因可能源于胎兒，并可能歸因于宮內(nèi)環(huán)境暴露的不利影響。例如，暴露于燃燒相關(guān)的大氣顆粒物污染（包括BC）與早產(chǎn)和宮內(nèi)生長(zhǎng)受限有關(guān)。此外，圍產(chǎn)期接觸 BC 也會(huì)在成年后誘發(fā)一系列疾病。 斑馬魚胚胎是探索發(fā)育毒理學(xué)機(jī)制的最有希望的模型之一。為了研究氧化鋯納米顆粒（ZrO2 NPs）對(duì)胚胎發(fā)育的影響，斑馬魚胚胎在受精后24–96 hpf內(nèi)注射0.5、1、2、3、4或5μg/mL的ZrO2 NPs。結(jié)果表明，0.5～1 μg/mL的濃度可引起胚胎急性發(fā)育毒性，并觀察到胚胎死亡、孵化延遲和畸形。暴露于ZrO2NPs會(huì)導(dǎo)致軸向彎曲、尾部彎曲、脊髓彎曲、卵黃囊和心包水腫。另一項(xiàng)研究調(diào)查了 CuO NPs 對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性。 受精后 4 小時(shí)至 96 hpf的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的 CuO NPs (0.5, 1,1.5 mg/L)。結(jié)果表明，CuO NPs 不能進(jìn)入斑馬魚胚胎組織，但可能導(dǎo)致死亡率增加、孵化延遲和心率下降。此外，CuO NP可導(dǎo)致頭尾畸形、脊椎畸形、卵黃囊水腫、心包水腫和其他類型的異常。暴露于 30 μg/mL CNPs 60 天，已觀察到成年斑馬魚心臟組織中吸收的碳顆粒的位置，并證明了含有 BC 的 CNPs 對(duì)斑馬魚心臟的潛在慢性影響。然而，BC 和含 BC 的 CNP 暴露影響胚胎發(fā)育的機(jī)制仍不清楚。因此，該研究選擇斑馬魚胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，購(gòu)買CNPs作為實(shí)驗(yàn)室替代品，以替代真實(shí)世界中含有BC的CNPs。斑馬魚胚胎在24、48、72和96hpf的孵化率和畸形指數(shù)被認(rèn)為是在暴露于CNPs后檢測(cè)到的。 此外，對(duì)對(duì)照組和暴露于 200 μg/mL CNPs 的斑馬魚進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組比較，以更好地了解差異表達(dá)基因 (DEGs) 和 CNPs 誘導(dǎo)胚胎發(fā)育毒性的潛在機(jī)制路徑。

CNPs對(duì)斑馬魚胚胎的毒性作用：48hpf對(duì)照組的孵化率為19.17%，而50、100和200 μg/mL濃度組的孵化率分別為5.83%、5.00%和2.50%，顯著低于對(duì)照組。72hpf對(duì)照組的孵化率為89.17%，而50、100和200μg/mL濃度組的孵化率分別為52.50%、48.33%和48.33%，也顯著低于對(duì)照組。此外，50、100和200μg/mL（96hpf）的畸形率分別為39.02%、50.68%和77.14%。已發(fā)現(xiàn)畸形胚胎，包括眼發(fā)育不全、心包水腫、血液循環(huán)障礙、卵黃囊畸形、脊索彎曲、尾巴彎曲、黑素細(xì)胞減少、心跳減慢，畸形數(shù)量隨著劑量和時(shí)間的增加而增加。在200μg/mL濃度組中，眼部發(fā)育不良、卵黃囊畸形和血液循環(huán)障礙等畸形的數(shù)量顯著高于其他組。僅在最高濃度組觀察到對(duì)觸摸無(wú)反應(yīng)的異常現(xiàn)象。

圖1、不同濃度組斑馬魚的孵化率和畸形率。（a）不同濃度組的48hpf和72hpf孵化率。（b） 不同濃度組的96hpf畸形率。

圖 2、 96 hpf 時(shí)暴露于 50,100,200?μg/mL CNPs 引起的表型變化。

圖 3、96 hpf 暴露于 CNP 的斑馬魚胚胎不同類型畸形的數(shù)量。

CNPs對(duì)基因表達(dá)的影響：RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，在 200?μg/mL CNP 和對(duì)照組中，從胚胎樣本中獲得的平均無(wú)污染讀數(shù)分別為 21876005 和 22549680。兩個(gè)樣本的平均基數(shù)比 6?G 更顯著。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明數(shù)據(jù)質(zhì)量可以滿足進(jìn)一步的分析。對(duì)暴露于CNPs的正常斑馬魚胚胎進(jìn)行RNA-seq和基因表達(dá)譜分析表明，共有236個(gè)基因差異表達(dá)，其中102個(gè)基因顯著減少，134個(gè)基因顯著增加。然后，對(duì)所有發(fā)生顯著變化的DEG進(jìn)行GO富集分析和進(jìn)一步的KEGG富集分析。DEGs的顯著富集有幾個(gè)GO術(shù)語(yǔ)，包括“生長(zhǎng)”、“節(jié)律過(guò)程”、“細(xì)胞外區(qū)域”、“抗氧化活性”和“解毒”。為了更好地研究 CNPs 對(duì)斑馬魚差異基因表達(dá)的調(diào)控，基于 KEGG 通路數(shù)據(jù)庫(kù)，DEGs 在功能上被歸類為典型的信號(hào)通路。根據(jù)top值，“光轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝”、“類固醇生物合成”、“類固醇激素生物合成”是主要的顯著調(diào)節(jié)途徑。KEGG富集網(wǎng)絡(luò)圖顯示，CNPs破壞了斑馬魚胚胎光轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因表達(dá)，包括兩個(gè)上調(diào)基因（enam、guca1e）和四個(gè)下調(diào)基因（guca1c、loc110437775、opn1mw2），以及7個(gè)氨基酸代謝途徑中的差異表達(dá)基因，包括5個(gè)下調(diào)基因（ASN、abat、psat1、gcshb、pipox）和2個(gè)上調(diào)基因（gls2b、agxtb）。此外，類固醇生物合成和類固醇激素生物合成途徑中有7個(gè)差異表達(dá)基因。 其中，上調(diào)基因?yàn)閔sd17b7、cyp3a65、cyp51和sqlea，下調(diào)基因?yàn)閏yp1a、sult5a1、ugt2b3。

圖 4. 96hpf 暴露于 200?μg/mL 的 CNP 的轉(zhuǎn)錄組分析。

通過(guò) RT-qPCR 驗(yàn)證 DEG：選擇富含類固醇生物合成和類固醇激素生物合成途徑的DEGs，從RNA-Seq結(jié)果中選擇7個(gè)基因（sult5a1、sqla、ugt2b3、hsd17b7、cyp1a、cyp3a65和cyp51）的表達(dá)，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證 RNA-Seq 數(shù)據(jù)。如圖 5 所示，對(duì)于上調(diào)和下調(diào)基因，qPCR 的結(jié)果與 RNA-seq 的結(jié)果非常吻合。

圖5、類固醇生物合成和類固醇激素生物合成信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)和驗(yàn)證。

討論：不同濃度的 CNPs 可誘導(dǎo)顯著的發(fā)育毒性。 與對(duì)照組相比，CNPs顯著干擾斑馬魚胚胎的正常發(fā)育，且孵化延遲和致畸作用呈時(shí)間和劑量依賴性。類似的研究表明，丁二烯煙灰 (BDS) 納米顆粒可能導(dǎo)致斑馬魚發(fā)育毒性，包括心包水腫、卵黃囊腫脹、軸向畸形。在這項(xiàng)研究中，觀察到卵黃囊畸形，這可能會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)代謝，從而影響胚胎發(fā)育。 在蛋黃發(fā)育過(guò)程中，胚胎可以利用蛋黃中積累的內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在魚卵中，內(nèi)源性脂質(zhì)儲(chǔ)備，主要是磷脂和三甘油，以卵黃球的形式存在。對(duì)卵黃囊的影響也可能是由于脂質(zhì)合成和代謝的改變。卵黃囊的任何損傷都可能阻礙胚胎發(fā)育期間的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，這可能是異常發(fā)育的原因。結(jié)果表明，在CNPs誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的許多異常表型中，48/72/96 hpf發(fā)現(xiàn)脊索彎曲呈劑量依賴性。脊索彎曲是本研究中觀察到的最重要的表型變化之一，可能導(dǎo)致胚胎骨骼畸形。心臟發(fā)育是胚胎發(fā)生的重要終點(diǎn)。 在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎有心包水腫和心臟血液循環(huán)障礙。2019年的一項(xiàng)研究表明，CNPs可以引起心肌組織顯著的超微結(jié)構(gòu)變化，并以劑量依賴性方式誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致心內(nèi)膜下炎癥和細(xì)胞凋亡。此外，本研究觀察到斑馬魚眼發(fā)育不全，可能影響斑馬魚的視覺(jué)發(fā)育。RNA-Seq 分析表明，光轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、類固醇和類固醇激素生物合成途徑比其他途徑顯著富集了更多的 DEG。在實(shí)驗(yàn)中，CNPs溶液呈黑色，尤其是濃度越高，CNPs溶液的顏色越深，這表明暴露組和對(duì)照組的光線不同。光在斑馬魚的發(fā)育中起著重要作用，影響視網(wǎng)膜的總厚度和感光細(xì)胞層的厚度，從而影響視覺(jué)的發(fā)展。色素減退是斑馬魚在沒(méi)有光照條件下發(fā)育時(shí)通常發(fā)生的一種變化。其他研究強(qiáng)調(diào)，暴露于斑馬魚胚胎/幼蟲中的污染物可能會(huì)改變與發(fā)育性眼病相關(guān)的晶體蛋白基因的基因表達(dá)水平。此外，暴露于氯氰菊酯48小時(shí)后，斑馬魚幼蟲的眼睛發(fā)育毒性可能會(huì)改變與視覺(jué)相關(guān)的基因，擾亂斑馬魚胚胎的光誘導(dǎo)途徑。在本研究中，我們觀察到斑馬魚的眼部發(fā)育不良和黑素細(xì)胞減少，以及光轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常表達(dá)，這表明應(yīng)使用敲除模型動(dòng)物來(lái)探索毒性效應(yīng)與機(jī)制途徑之間的關(guān)系。

類固醇和激素生物合成途徑是斑馬魚胚胎發(fā)育、代謝和內(nèi)分泌的重要途徑。RNA-seq分析和RT-qPCR數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)，CNPs暴露誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎毒性可能與甾體生成途徑中關(guān)鍵酶的基因突變有關(guān)。膽固醇作為類固醇激素的前體分子。 激素產(chǎn)生的限速步驟是將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)基質(zhì)，在那里它轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，sqlea是膽固醇代謝的關(guān)鍵基因之一。孕烯醇酮進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行進(jìn)一步的酶促反應(yīng)，產(chǎn)生各種類固醇激素。類固醇激素對(duì)性器官和行為的組織和發(fā)育、免疫功能、生長(zhǎng)和應(yīng)激反應(yīng)都很重要。細(xì)胞色素P450酶具有區(qū)域特異性，對(duì)于催化甾體生成途徑中的甾體原特異性反應(yīng)至關(guān)重要，我們的研究還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素P450酶基因的關(guān)鍵差異，包括cyp1a、cyp51、cyp3a65和ugt2b3。研究表明，cyp11a1在具有卵黃合胞層、染色體間原基、染色體間腺的斑馬魚胚胎中表達(dá)。胚胎斑馬魚的芯片分析和原位雜交顯示，cyp51在眼腦和尾鰭的額葉表皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，表明cyp51和其他異戊二烯合成酶可能在造血和血管發(fā)育中發(fā)揮作用。大多數(shù)CYP在發(fā)育過(guò)程中的作用和調(diào)節(jié)是未知的，阻礙了對(duì)發(fā)育毒性機(jī)制的理解。此外，催乳素受體相關(guān)蛋白/17β-羥基類固醇脫氫酶7型基因（hsd17b7）在胚胎發(fā)育和胎兒存活中起著關(guān)鍵作用。研究表明，敲除hsd17b7功能可能導(dǎo)致小鼠胚胎死亡、腦畸形和心臟缺陷。此外，胚胎發(fā)育中類固醇生物合成的途徑尚未闡明。雖然類固醇激素在成年斑馬魚中的作用已經(jīng)得到了很好的研究，但它們對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響還遠(yuǎn)未清楚。進(jìn)一步闡明類固醇和激素生物合成途徑在斑馬魚胚胎發(fā)育中的毒性機(jī)制可能很重要。

總之，我們首次證明了斑馬魚胚胎暴露于CNPs的發(fā)育毒性。RNA-Seq分析和RT-qPCR數(shù)據(jù)表明，CNPs暴露主要影響光轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、類固醇和類固醇激素生物合成途徑的DEGs。這些數(shù)據(jù)可以提供進(jìn)一步可能的研究方法，以更好地了解 CNP 在胚胎發(fā)育中的毒理學(xué)機(jī)制。

原文出自：The developmental toxicity and transcriptome analyses of zebrafish (Danio rerio) embryos exposed to carbon nanoparticles - ScienceDirect