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摘要：抗癌藥物毒性大，對環(huán)境有很大的危害。本研究的目的是采用一種創(chuàng)新的方法評估trabectedin對斑馬魚肝細(xì)胞系（ZFL）和胚胎幼蟲的毒性。在 ZFL 細(xì)胞中，使用 MTT 和臺盼藍(lán)排除測定法測量trabectedin的細(xì)胞毒性，并通過熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 和免疫熒光分析評估細(xì)胞形態(tài)。就死亡率/細(xì)胞活力而言，Trabectedin對ZFL細(xì)胞的毒性是斑馬魚胚胎幼蟲的60倍，在42.7μg/L時(shí)觀察到胚胎幼蟲死亡， 0.04μg/L時(shí)觀察到培養(yǎng)細(xì)胞無活力。免疫熒光染色顯示在0.04至0.15μg/L范圍內(nèi)暴露于trabectedin的ZFL細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變呈劑量依賴性. 此外，trabectedin在濃度低于50.3μg/L時(shí)會導(dǎo)致斑馬魚胚胎幼蟲的形態(tài)異常，例如尾部畸形、心包水腫和缺乏平衡。關(guān)于幼蟲行為分析，在黑暗條件下暴露于42.7μg/L的 trabectedin增加了斑馬魚的速度和總距離。這些結(jié)果表明，trabectedin對體外和體內(nèi)斑馬魚模型中都是有毒的，因此，這種抗癌劑在環(huán)境中的出現(xiàn)和持續(xù)存在可能是生物群的一個(gè)潛在風(fēng)險(xiǎn)因素。

關(guān)鍵詞：抗癌劑  斑馬魚的運(yùn)動行為  ZFL細(xì)胞  發(fā)育毒性  細(xì)胞毒性

簡介：全世界有數(shù)以千萬計(jì)的患者接受化療，預(yù)測表明癌癥病例數(shù)量將大幅增加，從而導(dǎo)致抗癌藥物（AAs）的使用增加。在給患者服用AAs后，由于廢水處理廠對生活和醫(yī)院殘留水的處理效果有限，AAs及其各自的代謝物會釋放到環(huán)境中。多項(xiàng)研究表明，AAs 存在于水生環(huán)境系統(tǒng)中，例如順鉑、依托泊苷、多柔比星、環(huán)磷酰胺和他莫昔芬，濃度范圍為 0.22 至 86.2 ng/L，而在地下水中，AAs 的含量為 2.1 至 29.7 ng/L。由于其作用機(jī)制通常包括與DNA的相互作用，AAs具有遺傳毒性、致癌性、致突變性和/或致畸性，長期接觸的情況下可能會對水生生物產(chǎn)生不良影響。已檢測到飲用水中存在 AA，置環(huán)境和人類健康于危險(xiǎn)之中。然而，水生環(huán)境中 AA 的存在及其對水生生物群和人類健康的影響尚未得到充分研究。trabectedin用于治療軟組織肉瘤，于 2007 年進(jìn)入歐洲市場，八年后進(jìn)入美國市場。分子通過結(jié)合DNA富含鳥嘌呤的特定序列，進(jìn)而影響修復(fù)機(jī)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和腫瘤微環(huán)境，從而維持其抗癌作用。與在高濃度 下具有細(xì)胞毒性的典型 DNA 嵌插劑（例如替莫唑胺和鉑化合物）不同，trabectedin在較低濃度下具有活性。正在進(jìn)行的研究和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步表明，trabectedin對骨肉瘤和結(jié)直腸腫瘤等其他類型的腫瘤有很好的治療前景?？紤]到trabectedin在治療方案中的使用越來越多，單獨(dú)使用或與靶向治療中的其他AAs結(jié)合使用，其在環(huán)境中已經(jīng)存在的可能性很高。因此，了解trabectedin在水生系統(tǒng)中的作用，了解其在環(huán)境中的持久性（半衰期）以及在水、污水污泥和廢水中的檢測值至關(guān)重要。大多數(shù)現(xiàn)有研究涉及trabectedin對哺乳動物和非人類測試模型的影響，重點(diǎn)關(guān)注對人類健康的直接影響，旨在更好地了解這種藥物的抗腫瘤潛力。因此，關(guān)于trabectedin的環(huán)境危害的信息存在重大空白。文獻(xiàn)中有關(guān)于AA對各種水生生物分類群的生態(tài)毒理學(xué)信息。5-氟尿嘧啶在低于 0.1 mg/L的水平下誘導(dǎo)生長抑制. 接觸順鉑21天會影響甲殼動物大型水蚤的繁殖量，EC50值為16μg/L。暴露于68μg/L環(huán)磷酰胺7天后會導(dǎo)致胚胎畸形。Gajski等人使用斑馬魚肝（ZFL）細(xì)胞系、人類肝癌（HepG2）細(xì)胞和人類外周血淋巴細(xì)胞（HPBLs）來評估5-氟脲嘧啶、順鉑和足葉乙甙的毒性，并表明非靶向ZFL細(xì)胞比癌細(xì)胞更敏感。AA 對非靶標(biāo)生物和細(xì)胞的危害性增加，因此有必要探索trabectedin的生態(tài)毒理學(xué)潛力潛力。本研究旨在深入了解trabectedin的環(huán)境毒性，從而更好地了解trabectedin在環(huán)境中的處置和分散是否會影響淡水魚類。此外，本研究旨在建立體外細(xì)胞模型預(yù)測整體動物效應(yīng)的可行性。

trabectedin對 ZFL 細(xì)胞活力和形態(tài)的影響：trabectedin在 24、48 和 72 小時(shí)后對 ZFL 細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，IC50 值見表1。用作參比化合物的多柔比星在孵育 24、48 和 72 小時(shí)后的 IC50 值分別是觀察到的trabectedin的 50、40 和 12 倍。

表1、MTT法分析trabectedin和多柔比星（陽性對照）對ZFL細(xì)胞的細(xì)胞毒性。TB 分析顯示，與溶劑對照 (DMSO) 相比，所有測試濃度（0.04、0.08 和 0.15 μg.L-1）的trabectedin導(dǎo)致 ZFL 細(xì)胞活力顯著降低。由于本研究中陰性對照組和溶劑對照組之間未觀察到顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此選擇溶劑對照組來比較我們的數(shù)據(jù)。進(jìn)行 FACS 分析以檢查分別由 FCS 和 SSC 軸定義的單元大小和內(nèi)部復(fù)雜性。隨著trabectedin濃度的增加，ZFL 細(xì)胞的直徑和粒度均有所降低。

圖 1. TB 排除法和流式細(xì)胞儀測定的 0.04、0.08 和 0.15 μg.L-1 trabectedin對 ZFL 細(xì)胞活力的影響。

為了進(jìn)一步觀察ZFL細(xì)胞的形態(tài)，對微管、F-肌動蛋白和細(xì)胞核進(jìn)行了免疫熒光染色。其中一個(gè)最顯著的影響是肌動蛋白絲的分布。對照細(xì)胞的外圍有密集的標(biāo)記，但暴露于trabectedin的細(xì)胞中呈彌漫性取向。這種改變在用最高濃度藥物處理的細(xì)胞中得到了高度證實(shí)。

圖2、暴露24小時(shí)后，對照組和trabectedin處理的ZFL細(xì)胞的免疫熒光染色。

對胚胎幼蟲存活和發(fā)育的影響：trabectedin對斑馬魚胚胎幼蟲的急性影響如表2和圖3所示。在暴露 trabectedin24 小時(shí)后導(dǎo)致死亡，LC50 為 95.5 μg.L-1。 在隨后的接觸天數(shù)中，死亡率增加，在 96 小時(shí)時(shí) LC50 值為 77.55 μg/L。暴露于trabectedin還對胚胎幼蟲造成亞致死效應(yīng)，例如發(fā)育異常，包括體節(jié)改變、心包水腫、尾部畸形和缺乏平衡。在24 hpf時(shí)，唯一可觀察到的效應(yīng)是體節(jié)改變，EC50為75.42μg/L。暴露發(fā)現(xiàn)心包水腫，在24、48和96 hpf時(shí)EC50分別為66.28、74.66和75.42μg/L。數(shù)值的增加并不意味著斑馬魚已經(jīng)康復(fù)，而是意味著水腫魚在隨后的幾天內(nèi)死亡，從而導(dǎo)致測量的亞致死效應(yīng)明顯降低。還觀察到尾部畸形，在72 hpf時(shí)畸形增強(qiáng)，EC50為42.66μg/L。在 96 hpf 時(shí)發(fā)現(xiàn)幼蟲缺乏平衡。

圖3、暴露于trabectedin的96 hpf斑馬魚幼蟲的致畸顯微照片

關(guān)于 96 小時(shí)的死亡率和畸形，LOEC 值（以觀察到影響的最低濃度表示）為 42.66 μg/L，而 NOEC 值（以未觀察到影響的最高濃度表示）為22.47 μg/L。

Trabectedin對行為的影響: 在第一個(gè)黑暗時(shí)期觀察到暴露于最高濃度trabectedin的幼蟲的游泳速度和總距離顯著增加。在其他濃度和階段，未觀察到進(jìn)一步的行為差異。對應(yīng)于斑馬魚運(yùn)動行為的LOEC值為42.66μg/L，而NOEC達(dá)到22.47μg/L。

結(jié)果：本研究揭示了抗癌劑trabectedin在相關(guān)的體外和體內(nèi)生態(tài)毒理學(xué)，對斑馬魚的影響，從 ZFL 細(xì)胞系的細(xì)胞骨架成分到胚胎幼蟲的發(fā)育和斑馬魚幼蟲的運(yùn)動。本研究揭示了抗癌劑trabectedin從ZFL細(xì)胞系的細(xì)胞骨架成分改變、胚胎幼蟲的發(fā)育和幼蟲的運(yùn)動對斑馬魚的影響。Trabectedin 是一種劇毒藥物，對斑馬魚細(xì)胞（非靶細(xì)胞和正常細(xì)胞）的影響與腫瘤細(xì)胞相同?？紤]到trabectedin的廣泛使用，這些研究結(jié)果支持了類似這項(xiàng)研究的必要性，以推斷trabectedin的潛在環(huán)境危害。斑馬魚細(xì)胞和胚胎的敏感性差異突出了斑馬魚細(xì)胞在減少不確定性和促進(jìn)淡水系統(tǒng)保護(hù)方面的潛在用途。在相關(guān)生態(tài)環(huán)境中斑馬魚幼蟲胚胎細(xì)胞系系統(tǒng)是評估抗癌化合物毒性的合適工具。

原文出自：Effects of trabectedin in the zebrafish Danio rerio: from cells to larvae - ScienceDirect