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　　小鼠腫瘤模型

　　自小鼠腫瘤模型的誕生已有一百多年的歷史，如今小鼠腫瘤模型在臨床前抗腫瘤藥物評價體系中發(fā)揮著重要的作用，為研究腫瘤發(fā)生與轉移的機制、篩選和評價抗腫瘤藥物的藥效提供了有力的工具。

　　小鼠腫瘤模型大致可分為自發(fā)性腫瘤小鼠模型、誘發(fā)性腫瘤小鼠模型、基因修飾小鼠腫瘤模型、異種移植瘤模型(PDX或CDX)、同種移植型小鼠腫瘤模型(CDA或MDA)等。其中，移植模型更易于和更廣泛用于臨床前藥效評價。

　　移植模型可分為細胞系移植和組織塊移植。我們今天主要關注的是使用率最高的皮下細胞系移植瘤模型。做過皮下移植瘤接種實驗的同學可能都遇到過，同時接種同等細胞量的小鼠長出的皮下瘤大小卻差異明顯，腫瘤不是過大就是過小，甚至形成串狀腫瘤或不成瘤，導致很難挑出均一的小鼠入組，進行后續(xù)的藥效試驗。那么，如何獲得均一性良好的皮下荷瘤小鼠模型?

　　考慮到皮下移植的過程，我們可以從以下幾個方面入手：

　　細胞

　　成瘤實驗前，選擇合適的細胞株是非常重要的，即便是同一個癌種，不同細胞株的成瘤能力也可能天差地別。

　　例如乳腺癌細胞系JIMT-1增殖速度就遠快于BT-474.因此建議大家先拿細胞株做個預實驗，以便正式實驗時合理安排實驗進度。

　　Tips：對于生長速度較慢的腫瘤細胞可選用基質膠，促進腫瘤生長，通常加入30-50%的基質膠。

　　不同乳腺癌細胞成瘤曲線

　　其次，細胞接種量和細胞狀態(tài)也是關鍵。接種細胞數(shù)量過少可能在老鼠皮下不能成瘤或成瘤后生長極慢，但接種量過多則可能引起腫瘤瘋長，出現(xiàn)這些情況并不利于實驗順利開展。細胞接種量一般通過查閱文獻確定或者做預實驗確認，預實驗通常在5E5-1E7細胞量之間設置梯度實驗，接種體積為100-200 uL(細胞過量可能導致泄漏)。

　　裸鼠皮下注射HepG2細胞4周后腫瘤形成圖

　　接種細胞要選擇生長狀態(tài)良好，無病毒、細菌或支原體等污染，處于對數(shù)生長期的細胞。細胞短途運輸時可采用濕冰運輸，如用冰袋，冰袋不可直接接觸細胞，若短時間內運輸室溫即可。

　　動物

　　選擇了合適的細胞株后，就要考慮用什么品系的小鼠來接種。對于來自小鼠的腫瘤細胞系，需要保持小鼠背景一致，如果腫瘤細胞系接種到背景品系不同的小鼠上，由于免疫系統(tǒng)的攻擊，腫瘤細胞很難成瘤。如MC38是來自B6小鼠的結腸癌細胞系，所以適于其接種的小鼠背景的是B6.

　　而藥效實驗用的細胞株多為人源細胞株，人源細胞株更為接近人類腫瘤增殖情況，但卻需要選擇免疫缺陷小鼠，如M-NSG小鼠。Raji細胞系是人Burkitt's 淋巴瘤細胞系，皮下接種后，腫瘤生長較慢，20天后腫瘤體積達到1000mm3.

　　確定品系后，就要選擇合適鼠齡的小鼠，通常為6-8周齡的小鼠，老年鼠皮下脂肪及結締組織疏松，容易接出不規(guī)則的腫瘤。同一批小鼠周齡和體重差異要盡量小。小鼠進入動物房后適應性飼養(yǎng)一周左右，待其適應新環(huán)境后再進行接種實驗。

　　圖3 MC38在C57BL/6小鼠皮下的成瘤曲線以及Raji小鼠在M-NSG小鼠皮下的成瘤曲線

　　操作

　　實驗員豐富的接種經驗極為重要，新手往往因經驗少而常出問題。如實驗前準備不夠充分，接種過程中手抖等。且新手實驗員操作速度較慢而使接種時間延長，使細胞活性下降進而影響成瘤率。所以，新手要多多練習接種或請經驗豐富的人員完成接種環(huán)節(jié)。

　　接種部位及接種深度也極為重要。選擇血管豐富的區(qū)域接種，如腋窩部位或頸后方的肩胛骨上側皮下等。進針時先用針頭刺破皮膚，持平注射器使針頭在皮下行進一段距離，稍微上挑后開始注射，注射過程中不可使針頭移行。注射結束后壓著針頭快速拔出，同時用棉簽輕壓進針孔處以免有細胞液流出。

　　接種環(huán)節(jié)應由一人完成所有動物接種，避免同一實驗多人。因每個人對卡尺的松緊和測量方向操作不同，為保持腫瘤體積測量的一致性，后續(xù)的量瘤環(huán)節(jié)也需要同一個人完成。

　　更多疑問?

　　1)如何避免串狀腫瘤

　　抽取細胞后，可用酒精擦拭針頭，避免針頭上的腫瘤細胞沾到行針路徑上。

　　2)接種針有氣泡怎么辦?

　　多取適當體積的液體，然后針尖朝上，往回吸一點，形成一個空間，再將空氣推出，同時有部分液體推出，氣泡即可以排除了。此時要注意腫瘤細胞比較粘，盡量排在紙上或者離心管里。

　　3)瘤子長不出來是怎么回事?

　　一方面可能是細胞狀態(tài)差，活力不好，或是腫瘤細胞不易成瘤，需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細胞系;一方面可能是小鼠周齡太大，或小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠(M-NSG小鼠>NOD SCID小鼠>裸小鼠)

　　4)小鼠瘤子長起來又消失?

　　腫瘤塊先縮小，后變大很常見，很可能是炎癥反應，導致腫瘤細胞被小鼠自身吸收，建議繼續(xù)觀察經過幾周是否能長出來，若否，則需要更換小鼠。

　　5)是否可以在一只小鼠進行多個點荷瘤?

　　不可以，一只老鼠就只能接種一個點。因為一個老鼠身上有多個腫瘤塊的情況下，可能會相互影響。