圖2. 熒光蛋白發展史 (A)， FPs的系統發育樹（B）

熒光蛋白的分類

表1. 通用熒光蛋白參數表

RFPs（紅色熒光蛋白）：

• mCherry具有優異光穩定性，是最通用紅色單體（但融合表達時有較弱的齊聚效應）

• tdTomato具有mCherry相同的光穩定性，亮度更強，是追蹤表達水平的理想選擇，但為串聯二聚體，可以在融合標簽大小不干擾蛋白質功能的情況下使用

• mStrawberry是最亮的紅色單體，但光穩定性要弱于mCherry

• DsRed是細胞毒性最小的RFP

• mApple在蛋白的融合表達中是mCherry理想的替代物，但其光穩定性要遠弱于mCherry

• mKate2從參數方面考量是綜合亮度、光穩定性和齊聚性的最佳RFP，但目前報道相對較少

OFPs（橙色熒光蛋白）：

• mOrange是最亮的橙色單體

YFPs（黃色熒光蛋白）：

• YPet具有極高的光穩定性且成熟快,亮度極高

• mVenus是亮度極高的黃色單體

GFPs（綠色熒光蛋白）：

• EGFP是目前適用范圍最廣的FP，綜合多個優勢屬性

• GFP是最早發現的熒光蛋白，應用廣泛

CFPs（青色熒光蛋白）：

• mTurquoise是最亮的青色單體

• CyPet是最穩定的CFP

BFPs（藍色熒光蛋白）：

• mTagBFP2是最穩定，成熟極快、亮度極亮的藍色單體

熒光蛋白選擇八要素

• 激發波與發射波——我們選擇的光學系統需能夠有激發FP合適的激發光，并同時有檢測FP發射光的合適通道

• 齊聚度——融合表達時，選擇易齊聚的FP可能會影響其融合蛋白的生物學功能或定位，此時應盡量選擇單體FP

• 亮度——選擇足夠亮的FP才能提供足夠信號以便檢測和成像

• 光穩定性--FP應具有足夠的光穩定性以使其穩定成像

• 成熟時間--FP正確折疊并形成發色基團所需的時間

• pH穩定性--某些FP隨著pH的變化會改變熒光強度，可用于檢測pH變化/胞吐作用

• 分子氧--許多FP上的發色基團成熟需要氧氣，因此該類FP不能在缺氧環境使用

• 溫度--FP的成熟時間和熒光強度會受到溫度的影響，需根據實驗溫度環境選擇FP

有了上文提到的八要素評價體系后，我們就該考慮在實際實驗中如何運用這些熒光蛋白。

熒光蛋白應用示例

將示蹤基因敲入到小鼠內源基因的或5'端或3'端，且與內源基因融合表達，可以確定內源蛋白的亞細胞定位（如圖3所示）。熒光標簽插入位置的決定因素：1. 已有文獻的報道，首先考慮已有的參考模型；2. N端或C端有無蛋白修飾，避免插入的位置進行蛋白翻譯后的修飾；3. 離主要功能域遠的N端或C端，確保蛋白正常功能的行使。總之，熒光標簽插入的位置應盡量避免影響蛋白的正常功能。

圖3 用于蛋白亞細胞定位研究的小鼠模型構建示意圖

例如，中科院生化所張雷、周斌等[6]發現Vgll4基因全身敲除小鼠大部分會出生前死亡，而少部分存活的小鼠體型偏小、有嚴重的心肌肥大，還伴有心臟血液回流以及心臟瓣膜異常增厚等癥狀。隨后他們通過構建Vgll4-EGFP熒光示蹤小鼠觀察Vgll4基因的表達時間及亞細胞定位（如圖4所示），發現Vgll4基因從胚胎期的13.5天開始表達在小鼠主動脈瓣、肺動脈瓣間充質細胞的細胞核中，并持續表達在成體心臟動脈瓣膜的間充質細胞中。這些結果首次闡明了作為Hippo信號通路拮抗劑的VGLL4在心臟瓣膜發育以及穩態調節過程中的重要功能，為心臟瓣膜疾病的預防和治療提供了新的靶點。

圖4 Vgll4-GFP融合蛋白的亞細胞定位檢測

常見的有兩種方式。第一種方式是，將熒光示蹤基因通過2A（自剪切多肽）或IRES（內部核糖體進入位點序列）敲入到小鼠內源基因的3'端，對內源基因表達進行示蹤（如圖5所示）；第二種方式是，將熒光基因敲入到小鼠內源基因的5'端，通過終止序列polyA與內源基因連接，可以實現內源基因的替代表達，通過觀察熒光示蹤基因的表達了解內源性蛋白的表達情況，例如：是否表達、表達量、表達組織分布等等。

圖5 用于蛋白表達譜研究的小鼠模型構建示意圖

例如，為尋找激活褐色脂肪細胞的小分子物質，研究人員在褐色脂肪成熟標志物解偶聯蛋白(UCP1)終止密碼子前定點敲入綠色熒光蛋白(GFP)表達框，建立了成熟褐色脂肪組織細胞熒光示蹤的小鼠模型（如圖6所示）。隨后作者喂食熒光示蹤小鼠1000余種臨床用藥通過觀察熒光強度來檢測體內Ucp1基因的表達水平，結果發現sutent能顯著促進褐色脂肪細胞中UCP1的表達。本研究結合熒光標記的基因示蹤小鼠模型和大規模化合物篩選，建立了一個篩選調控褐色脂肪組織細胞激活劑的高效實驗體系，也為肥胖及相關代謝型疾病研究提供了新的思路[7]。

圖6. Ucp1-2A-GFP熒光示蹤小鼠的構建及褐色脂肪組織熒光強度的檢測

 4.3   用于細胞系示蹤的研究?

利用Rosa26-LSL-reporter示蹤小鼠，與特定細胞標記基因敲入Cre的工具小鼠交配，在子代小鼠中特定類型細胞被永久標記上報告基因熒光（如圖7所示），通過觀察這些被標記上的熒光信號可以追蹤某類特定細胞及其后代所有細胞的增殖、分化以及遷移等活動，為研究細胞命運及譜系提供有力手段。

圖7. 用于細胞譜系示蹤研究的小鼠模型構建示意圖

例如，研究人員利用基于Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組的報告基因小鼠R26-RSR -LSL-tdTomato，并結合能特異性標記CC10+細胞的Scgb1a1-CreER小鼠和特異性標記SPC+細胞的Sftpc-DreER小鼠，通過交配獲得Scgb1a1-CreER;Sftpc –DreER ; R26-RSR-LSL-tdTomato（BASCs tracer）三基因型小鼠來特異性標記CC10+SPC+BASCs。通過體內驗證，此策略能特異性地標記示蹤BASCs。研究發現位于支氣管肺泡交界處的BASCs（肺支氣管肺泡干細胞）具有多種肺上皮細胞分化的潛能，并結合多種小鼠損傷模型揭示了這群干細胞在體內具有再生肺臟的能力，為肺臟的修復和再生研究提供了新的研究方向及理論基礎[8]。

圖8. 基于雙同源重組系統的BASCs遺傳譜系示蹤

無論在融合表達還是非融合表達實驗中，我們時常會面臨需要選擇多個熒光蛋白進行共成像的實驗需求，例如追蹤多基因表達水平、亞細胞定位、研究蛋白互作和細胞篩選等。

圖9 熒光蛋白用于多色實驗

選擇熒光蛋白進行多色實驗時除了考慮上述提到的基本八要素，還要兼顧熒光蛋白的兼容性。其中，選擇兼容熒光蛋白遵守的原則是：選擇不同熒光的峰值激發波長和峰值發射波長都應分開50-60 nm以上。

例如，CFP（ex 430 nm / em 474 nm）和YFP（ex 514 nm / em 527 nm）可以一起成像，但CFP和GFP（ex 488 nm / em 507 nm）在顯示時會存在一些串擾。

目前一些比較常用的多色FPs組合：

雙熒光（綠-紅）：

EGFP+mCherry

EGFP+tdTomato

EGFP+mKate2

雙熒光（青-黃）：

CyPet+YPet

三熒光（藍綠紅/青黃紅）：

mTagBFP2+EGFP+mCherry

mTagBFP2+EGFP+tdTomato

mTagBFP2+EGFP+mKate2

CyPet+YPet+mCherry

CyPet+YPet+mKate2

希望今天的干貨分享對每一位熒光蛋白的使用者有所幫助，在選擇熒光蛋白時，不再迷茫！

參考文獻：