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摘要：斑馬魚是模擬人類疾病的重要動物系統。 這包括腎功能障礙，因為胚胎腎（前腎）與人類腎單位在分子和形態方面同源性高。腎病的一個關鍵臨床指標是蛋白尿，但目前缺乏斑馬魚蛋白尿的高通量判讀。為了解決這個問題，我們使用Tol2轉座子系統生成了轉基因斑馬魚系，該系使用fabp10a肝特異性啟動子過度表達與受體相關蛋白D3結構域融合的納米熒光素酶分子（一種分子伴侶），我們稱之為NL-D3，我們通過測量胚胎培養基中的發光強度來定量NL-D3斑馬魚仔魚的蛋白尿。使用光度計，通過測量胚胎培養基中的發光強度來量化 NL-D3 斑馬魚仔魚中的蛋白尿。在健康狀態下，NL-D3 不會被排出，但是當用影響近端腎小管重吸收（順鉑、慶大霉素）或腎小球濾過（血管緊張素 II、漢克斯平衡鹽溶液、牛血清白蛋白）的化學物質處理胚胎時，在魚培養基中檢測到NL-D3。類似地，與腎臟疾病相關的幾種基因產物（nphs1、nphs2、lrp2a、ocrl、col4a3和col4a4）的缺失也誘導了NL-D3蛋白尿。用卡托普利治療缺乏col4a4的斑馬魚仔魚（Alport綜合征模型）可減少蛋白尿。研究結果證實了NL-D3轉基因斑馬魚作為一種穩健和可量化的蛋白尿報告品系的使用。鑒于斑馬魚高通量檢測的可行性，NL-D3轉基因斑馬魚將允許篩選改善蛋白尿的藥物，從而優先考慮進一步轉化研究的候選藥物。

關鍵詞：Alport綜合征  基底膜  腎小球  蛋白尿  近端小管  IV型膠原   斑馬魚

蛋白尿是腎臟疾病的重要臨床指標。 使用尿液試紙，可以在幾秒鐘內確定尿液中是否存在蛋白質。對尿液中蛋白質分子大小的進一步評估表明腎單位功能缺陷的位置。尿液中大蛋白的存在表明腎小球濾過器功能紊亂，而低分子量蛋白的存在則表明近端小管功能紊亂。斑馬魚是研究腎臟發育和疾病的流行模式生物，但目前缺乏蛋白尿的定量報告。胚胎斑馬魚發育出一個功能正常的前腎，其分子和結構與人類腎單位相似。前腎由單個中線融合腎小球組成，附著于雙側小管，沿其前后軸分割為不同的近端和遠端區域。測定斑馬魚胚胎腎功能的最佳方法是使用不同分子量的熒光右旋糖酐來區分腎小球和近端小管功能障礙。熒光右旋糖酐對蛋白質內吞的細胞機制沒有特異性；這些方法是有用的，但它們不是定量的，且不能以高通量方式使用，不能特異性識別近端小管中巨蛋白介導的內吞缺陷。斑馬魚轉基因報告基因品系(fabp10a:?vdbp-mCherry) 使胚胎培養基能夠被收集并檢測低分子量蛋白質。這一功能強大的系統允許定量蛋白尿作為近端小管中lrp2/巨蛋白內吞途徑功能障礙的判讀。通過免疫熒光成像或酶聯免疫吸附測定，報告近端小管功能障礙，以量化近端小管中的蛋白攝取和蛋白尿。這種遺傳工具突出了轉基因在斑馬魚中開發蛋白尿報告基因的潛力。我們描述了一種新的基于納米熒光素酶（NL）的斑馬魚蛋白尿報告基因。胚胎培養基中排泄的NL蛋白在添加其底物熒光素后通過發光檢測。利用這一新系統可以高通量方式測定近端腎小管和腎小球功能的變化。

體外重組 NL-D3 可被內吞：目的是開發一種轉基因報告基因來研究斑馬魚前腎近端小管的內吞作用。近端小管內吞途徑的一個重要組成部分是具有多個配體的600 kDa巨蛋白受體。巨蛋白的功能和加工依賴于受體相關蛋白，該蛋白包含與巨蛋白具有不同親和力的三維結構域。我們將大鼠受體相關蛋白與NL融合。全長受體相關蛋白-NL融合產生大小為58kDa的蛋白。假設限制報告蛋白的大小有助于其通過腎小球毛細血管壁，因此我們將受體相關蛋白的14 kDa D3結構域融合到NL的C端，以產生NL-D3，其預測大小為35.5 kDa。我們首先想確認 NL-D3 融合蛋白可以報告巨蛋白依賴性內吞作用。在大腸桿菌中表達重組 NL-D3，并分離純化蛋白質。然后將重組NL-D3用于HEK293細胞的攝取實驗，該細胞穩定表達截短的megalin。通過裂解細胞并測量發光來測量攝取，與用重組NL-D3孵育的對照HEK293細胞相比，用重組NL3-D3培養的HEK293-MmR4細胞具有大約10倍高的攝取水平。對照HEK293細胞和HEK293-MmR4細胞在與NL孵育后均未顯示發光。這些體外結果表明 NL-D3 與巨蛋白結合并容易被內吞。

圖1. NL-D3被巨蛋白內吞途徑攝取。

γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑馬魚：為了開發一種可行的近端小管內吞作用的體內報告者，我們轉向斑馬魚模型。使用多功能 Tol2 基因轉移系統生成轉基因斑馬魚，在肝臟特異性 fabp10a 啟動子的控制下表達 NL-D3。為了進行選擇，轉座因子在γ-晶體蛋白啟動子的控制下雙重表達McHery。5-dpf的轉基因的γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑馬魚（下文稱為NL-D3）的全胚胎裂解物的發光比野生型胚胎高約100000倍。成年期NL-D3報告魚分離的血液中觀察到類似的發光增加。還測量了成年期器官組織中NL-D3的含量，肝臟的發光最多。轉基因斑馬魚中NL-D3的肝臟特異性表達導致該報告物強烈釋放到血管系統中。培育了多代NL-D3轉基因斑馬魚，沒有觀察到對魚類整體健康或壽命的任何影響。NL-D3斑馬魚和年齡匹配對照組肝臟的組織學分析顯示無明顯變化。

NL-D3 胚胎檢測近端小管功能障礙：為了測試 NL-D3 是否通過腎小球濾器并被前腎近端小管中的巨蛋白內吞途徑重吸收。近端小管對10 kDa熒光右旋糖酐的再攝取評分為正常、低或無。與對照組（n=40）相比，lrp2a的缺失足以嚴重減少近端小管中10 kDa熒光右旋糖酐的攝取（n=39）。將4 dpf的lrp2a變體置于96孔板的1孔中，更換胚胎培養基，用光度計測量胚胎培養基中的NL-D3含量。與每孔 1 個胚胎相比，每孔 3 個胚胎（n = 9孔）在發光測量中產生的變異性較小。還測量了1小時、4小時、8小時和24小時取自lrp2a變體的胚胎培養基的發光（每個時間點n=9）。NL-D3 報告基因的靈敏度足以在短短 1 小時后評估蛋白尿，但對照和實驗樣品之間的分離在 24 小時時最大。我們在所有的分析中都使用了這個時間點。使用重組NL-D3生成的標準曲線，將從光度計獲得的相對發光單位定量轉換為NL-D3量（ng/ml）。lrp2a的缺失導致胚胎培養基中存在的NL-D3增加約29倍。另一種與近端小管內吞作用有關的基因產物是OCRL，致病性變體導致Lowe綜合征，與低分子量蛋白尿相關。我們還測試了靶向近端小管并誘導蛋白尿的腎毒素的作用。慶大霉素和順鉑是 2 種公認的腎毒素藥物，主要通過近端小管細胞死亡引起腎臟損傷，以前曾用于消融斑馬魚近端小管上皮。胚胎培養基中 NL-D3 分泌的分析表明，與賦形劑對照相比，0.5 nl  6 ng/μl 慶大霉素使蛋白尿增加約 13 倍。用雙倍量的慶大霉素處理胚胎使蛋白尿進一步增加至對照（n = 12）的約 534 倍，表明在 NL-D3 報告基因中可檢測到劑量反應。順鉑也獲得了類似的劑量反應，低劑量（0.5mM）導致蛋白尿增加約1.5倍，高劑量（1.5mM）引起約6.7倍。這些結果證實了NL-D3轉基因魚是一種可行的工具，用于檢測近端腎小管功能障礙引起的蛋白尿。

圖 2. NL-D3 斑馬魚可用于檢測近端小管功能障礙。

NL-D3胚胎檢測腎小球功能障礙：我們進一步分析了干擾腎小球特異性基因表達的影響，以確定 NL-D3 報告基因是否也可用于測量與腎小球功能障礙相關的蛋白尿。NPHS1 和 NPHS2 編碼建立足細胞裂孔隔膜的蛋白質。這些基因的致病性變異導致腎病綜合征，其特征是蛋白尿過多。使用與 Fukuyo 等人使用的相同的嗎啉代寡核苷酸，我們觀察到 500 kDa 異硫氰酸熒光素綴合的葡聚糖從脈管系統中清除，證實嗎啉代會導致腎小球功能障礙。這些結果表明，NL-D3報告基因作為腎小球和近端腎小管功能障礙的雙重報告基因。對斑馬魚前腎腎小球發育的透射電子顯微鏡分析表明，在大約 4 dpf 時建立了完全形成的過濾屏障。前腎小管的分化早于此，受精后48小時出現刷狀邊緣和近端-遠端分割。測試了NL-D3報告基因是否可以在早期發育階段用于檢測與近端小管功能障礙或腎小球功能障礙相關的蛋白尿。發現在對照組（n=20）、nphs1變體（n=16）、lrp2a變體（n=12）或ocrl變體中，在24和48 hpf之間的報告者中均未檢測到腎小管或腎小球相關蛋白尿。

圖3.NL-D3斑馬魚也可用于研究腎小球疾病。

斑馬魚colIV基因的表達分析：鑒于與腎小球病理相關的腎臟疾病過多，NL-D3斑馬魚系測量腎小球功能障礙的潛力令人感興趣。其中一種情況是阿爾波特綜合征，由人類COL4A3、COL4A4或COL4A5的變異引起。COL4A3、COL4A4或COL4A5的變體導致GBM中膠原a3a4a5（IV）減少或缺失，影響其長期功能。阿爾波特綜合征患者最初出現微量血尿，隨后出現蛋白尿，腎功能逐漸下降，導致腎衰竭。斑馬魚腎小球中 IV 型膠原蛋白鏈的表達譜以前沒有被表征過。 斑馬魚有 6 個 IV 型膠原基因 col4a1-a6，它們是人類中發現的 6 個 IV 型膠原基因 (COL4A1-A6) 的直系同源物。進行了原位雜交以檢測4dpf斑馬魚胚胎中col4a1–a6轉錄物的空間組織，這是腎小球完全發育的時間點。預期col4a1和col4a2的表達譜是相同的，因為脊椎動物IV型膠原基因的表達是通過col4a1/col4a2、col4a3/COL4B4和COL4B5/COL4S6的假定雙向啟動子調控的。在血管系統中檢測到 col4a1 和 col4a2 轉錄物，最顯著的是在主動脈弓、中央動脈和頭部區域的原始后腦通道中。在橫切胚胎中清楚地觀察到 col4a1 的腎小球定位。與 col4a1 和 col4a2 相比，col4a3 和 col4a4 表達譜受到更多限制。在晶狀體囊和腎小球中觀察到col4a3和col4a4的高水平表達，在鰓弓中檢測到弱表達。使用原位雜交，我們無法檢測腎小球中col4a5的表達，盡管使用了不同的探針。

圖4. 斑馬魚腎小球中表達IV型膠原

鑒于斑馬魚 NL-D3 轉基因報告系可用于檢測腎小球功能障礙，其中蛋白尿是關鍵臨床特征，例如在 Alport 綜合征中，我們接下來嘗試使用化學方法挽救腎小球濾過以確定該系統用于復合篩選的潛力。col4a4 crispants被用作阿爾波特綜合征的模型。對3 dpf至5 dpf的col4a4 crispants施用卡托普利來降低全身血壓，我們測定了4 dpf至5dpf的蛋白尿。卡托普利是一種血管緊張素轉換酶抑制劑，以前曾用于斑馬魚以降低血壓。假設降低全身血壓也會降低腎小球內壓。我們發現卡托普利治療對未注射的斑馬魚胚胎沒有影響，但幾乎完全防止了col4a4 crispants的蛋白尿。使用2,3-丁二酮2-單肟降低3 dpf至5 dpf斑馬魚胚胎的心率。假設較低的心率會導致腎小球灌注減少，從而減少腎小球濾過。野生型斑馬魚胚胎劑量反應分析表明，濃度為7.5μM的2,3-丁二酮2-單肟足以顯著降低心率。血管緊張素 II 是一種肽激素，可通過誘導血管收縮來增加血壓。發現 0.5 μM 血管緊張素 II 不會導致 NL-D3 胚胎出現蛋白尿； 然而，5 μM 血管緊張素 II 導致蛋白尿增加約 3.4 倍（n = 12）。注射 Hanks 平衡鹽溶液或 10% 牛血清白蛋白會導致 NL-D3 報告胚胎中的蛋白尿急劇增加。漢克斯平衡鹽溶液是一種鹽水溶液，注射時會導致水流入血管系統，并已被證明會擴張腎小球毛細血管。假設注射 Hanks 平衡鹽溶液會在腎小球中產生急性機械負荷從而導致蛋白尿。，我們觀察到 500 kDa 熒光素異硫氰酸酯共軛葡聚糖的清除率增加支持這一點。我們檢測到Hanks平衡鹽溶液注射的 NL-D3 胚胎發光增加了大約 128 倍。這些數據證實NL-D3報告系可以檢測與全身血壓和腎小球灌注變化相關的蛋白尿。他們還強調了這一新工具在腎功能治療篩查中的潛力。

結論：我們的數據顯示了基于 NL 的斑馬魚品系蛋白尿報告基因的開發。 鑒于該系統在實驗可用性和高通量篩選的可行性方面的優勢，預計這種新的蛋白尿報告基因將成為腎臟研究人員工具包的寶貴補充。

原文出自：A novel nanoluciferase transgenic reporter measures proteinuria in zebrafish - ScienceDirect