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美鳳力臨床前大動物實驗中心
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簡介：納米材料因其體積小、用途廣泛等特點，在工業和醫學領域得到廣泛應用。然而，納米材料也會對健康產生意想不到的不利影響。 神經系統暴露于納米材料會導致嚴重的神經功能障礙和神經退行性疾病。許多研究采用各種動物模型來評估納米材料的神經毒性作用。斑馬魚因其良好的神經系統特征、高效的基因組編輯、方便的轉基因品系生成、高分辨率體內成像和一系列行為分析等優勢，已成為神經毒性研究的一個有吸引力的動物模型。總結了最近使用斑馬魚對納米材料，特別是工程納米材料和納米塑料的神經毒性效應的研究，并討論了斑馬魚模型在神經毒性研究中的優勢和局限性。
關鍵詞：納米材料 聚苯乙烯納米材料 工程納米材料 斑馬魚 動物模型 神經毒性
簡介：納米材料由有機、無機或有機金屬材料組成的納米尺寸材料，可分為天然、偶然和工程納米材料 (ENM)。由于尺寸小，具有不同尋常的特性，可應用于各種領域，例如納米生物技術或納米醫學。由于獨特的性質對納米材料安全性的擔憂也在增加。納米材料可以通過多種途徑進入人體，例如消耗納米產品或吸入偶然的納米材料。體內的納米材料可能穿過生物屏障穿透各種器官，并與固有的生物系統相互作用意味著它們會意外地造成不良影響。特別是暴露于人體的納米材料可以從鼻子、肺、胃腸道或皮膚轉移到通過血液和淋巴系統到達大腦，并可能導致神經功能障礙和神經退行性疾病。大量研究報告了納米材料的神經毒性效應主要集中在ENM上。納米塑料（NPs）是納米毒性的另一類重要納米材料，是由塑料廢物通過風化作用偶然形成的。基于它們的定義、物理化學性質以及環境命運和行為，它們與 ENM 不同。除了細胞研究外，使用適當的動物模型進行毒性評估是必不可少的。已采用各種動物模型來證明納米材料通過多種病因引起神經功能障礙和相關疾病，例如炎癥、氧化應激、DNA 損傷和神經元死亡。ENMs的神經毒性主要通過嚙齒動物模型（如小鼠或大鼠）進行評估，而NPs的神經毒性則通過魚類模型進行評估。在動物模型中，小鼠是最受歡迎的神經毒性動物模型之一：它具有復雜行為分析的優勢，與人類同源的器官和基因以及各種遺傳工具和疾病模型具有高度相似性，但實驗成本低，實驗周期長 , 倫理問題是它作為動物模型的局限性。另一種用于神經毒性研究的新興動物模型是斑馬魚，它在評估納米材料對 ENM 和 NPs 的神經學影響方面具有若干優勢，包括神經行為、神經發育和神經功能測定。盡管使用斑馬魚對納米材料的神經毒性研究仍處于初級階段但它們在不同的研究領域有許多潛在的應用。討論了以斑馬魚為動物模型的人類納米材料神經毒性的最新研究并提出了進一步神經毒性研究的方向。
納米材料在動物模型中的神經毒性：由于形態、物理化學和生物學特性，ENMs 和 NPs 都可能對健康產生不利影響。暴露于神經系統的納米材料可能會誘發神經元失調并最終導致相關的神經系統疾病，包括嚴重的神經退行性疾病，如阿爾茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD) 和亨廷頓病。討論了納米材料的特性與其毒性之間的相關性，并總結了最近使用動物模型（不包括斑馬魚）對ENMs和NPs引起的神經功能障礙的研究。
ENMs的特性和毒性：ENM是人類有意設計或生產的納米材料，包括金屬和金屬氧化物納米顆粒。環境管理系統的多樣性、復雜性和復雜性得到了顯著改善，導致其應用于各個領域，包括食品工業、化妝品、體育、紡織和醫藥。ENM也可能與神經系統中的非目標生物實體相互作用最終導致認知障礙和神經退行性疾病，突出其獨特的雙刃特征。ENM的形態特征是指具有一個或多個維度的小于或等于100nm的納米材料。形態特征（如大小和形狀）可能影響ENM與生物系統的相互作用，包括內吞作用、生物分子吸收或器官分布。小鼠體內氧化鐵磁性納米粒子 (IOMNs) 的毒理學研究表明器官分布具有大小依賴性，較小尺寸的 IONMs 穿透更深并誘導與氧化應激和代謝過程相關的基因表達顯著變化。基于銀納米粒子 (AgNPs) 的毒理學研究還表明，較小的尺寸會通過誘導氧化應激或金屬離子釋放來增加毒性。此外，ENM 的形狀會影響它們的毒性，阻礙它們的清除。
ENM的物理化學特性（如組成、電荷、疏水性、表面官能團等）是決定其命運的關鍵因素，與毒性密切相關。金屬基 ENM 的命運會受到各種因素的影響，例如 pH 值、溫度、離子強度、溶解氧和天然有機物，所有這些都會影響它們的毒性。例如，金屬離子可能通過酸性pH從金屬基ENM（ZnO或Ag）中釋放，可能對生物體造成毒性。AgNPs的毒理學研究表明氧水平或pH值會加速AgNPs表面銀離子的釋放，可能導致氧化應激或炎癥反應。表面電荷和疏水性也會影響 ENMs 的毒性。 帶正電荷或疏水的 ENM 比帶負電荷的 ENM 或親水 ENM 更容易被細胞內化并誘導氧化應激、自噬和細胞凋亡。ENMs 的這些形態和物理化學特性使它們能夠與蛋白質、膜、磷脂、細胞器或 DNA 等生物成分積極相互作用從而誘導細胞內攝取、組織穿透、分布和器官積累對生物體產生不利影響。蛋白質電暈的形成可以改變與生物實體的相互作用及其毒理學效應。需要將ENM與不同生物成分的相互作用視為了解其毒理學效應的重要特征。
ENMs在動物模型中的體內神經毒性：已經在細胞系中研究了具有不同形態、物理化學特征和生物相互作用的 ENM 的神經毒性作用。二氧化硅納米粒子 (SiO2-NPs) 影響神經元 PC12 細胞周期、細胞凋亡和多巴胺表達，氧化鋅納米粒子 (nano-ZnO) 破壞神經元 PC12細胞增殖。與使用神經元細胞系進行的大量關于ENM對特定神經元細胞損傷的關鍵研究相比，體內研究仍然有限。除嚙齒動物模型（如小鼠和大鼠）外，包括蠕蟲（秀麗隱桿線蟲、秀麗隱桿蟲）、蒼蠅（果蠅、黑腹果蠅）或斑馬魚在內的幾種動物模型已被最常用于神經毒性研究。嚙齒動物作為最流行的神經毒理學模型，觀察到各種神經學效應，包括 ENM 易位到神經系統、活性氧 (ROS) 生成、炎癥和器官反應。AgNPs轉移到小鼠模型的大腦會造成有害影響，如長期記憶障礙。暴露于 TiO2、ZnO 或 Al2O3 納米顆粒的小鼠大腦表現出大腦皮層中多巴胺和去甲腎上腺素和氧化應激的增加。小鼠大腦中的 AgNP 治療導致乙酰膽堿酯酶、多巴胺和血清素的消耗。Fe3O4 納米顆粒在大鼠腦的紋狀體和海馬中積累，并導致神經元活力和氧化應激降低。TiO2納米顆粒（TiO2 NP）誘導的氧化應激由p38-Nrf2信號通路介導，伴隨著炎性細胞浸潤到小鼠大腦和破裂的神經細胞中。嚙齒動物模型允許分析ENM暴露的各種影響，例如神經毒性的分子機制和神經遞質變化。嚙齒動物模型還可以根據器官反應評估代際影響的風險。小鼠妊娠和哺乳期暴露的TiO2 NP會誘導小鼠后代海馬的凋亡和神經發生減少，損害記憶和學習，以及后代小鼠的大腦發育和認知障礙。
非嚙齒動物模型，如黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲或斑馬魚，正在成為傳統嚙齒動物模型的有價值替代品，允許利用多種分子和遺傳工具。黑腹果蠅具有多種優勢，例如易于區分的表型陣列、易于進行基因操作與人類致病基因的相似性高于 70%以及倫理問題少等優勢。暴露于 AgNPs 和 ZnO 納米顆粒可誘導黑腹果蠅神經毒性，例如神經母細胞畸形和神經肌肉協調。黑腹果蠅的多種神經退行性疾病模型可用于研究神經系統影響，例如運動障礙和神經毒性反應，用于神經毒性研究。秀麗隱桿線蟲包含幾乎所有涉及哺乳動物神經遞質的基因家族，神經元損傷和神經元動力學再生可以用熒光標記物可視化。長期暴露于 Al2O3 納米顆粒 (Al2O3-NPs) 可導致秀麗隱桿線蟲運動行為、應激反應和氧化應激下降。Al2O3-NPs 通過影響秀麗隱桿線蟲的谷氨酸能、5-羥色胺能和多巴胺能系統來影響運動行為。
NPs 在體內動物模型中的神經毒性：盡管提出了納米塑料的風險，但已對有限類型的塑料（包括PS）進行了測試，只有少數研究報告了使用嚙齒動物模型的NP誘導的神經效應，這與許多ENM神經毒性研究不同。主要使用細胞系或非嚙齒動物模型進行研究NPs的神經毒性。暴露于聚苯乙烯納米塑料（PSNP）的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞顯示出突起生長收縮、細胞核形態改變和腫脹以及細胞內成分溢出。PSNP通過小泡介導的內吞作用被SH-SY5Y細胞內化，并可誘導錯誤的細胞凋亡。對秀麗隱桿線蟲中NPs 的神經毒理學研究表明，PSNPs 誘導 ROS 產生和線粒體損傷從而抑制體長、身體彎曲和多巴胺含量。主要利用海洋生物來評估NPs的神經毒性。 幾項魚模型研究表明PSNPs 在大腦中積累并誘導不利的神經系統影響，例如大腦體重減輕、乙酰膽堿酯酶 (AChE) 抑制和行為變化，表明 NPs 也可以誘導神經系統功能障礙。在各種動物模型中，斑馬魚模型是評估 NPs 神經效應的流行模型之一。 下面將進一步討論使用斑馬魚作為 NPs 神經毒理學研究的動物模型的特征、優勢、局限性和未來方向。
圖 1 具有不同形態和特征的ENMs和NP代表的納米材料的物理化學特征以及用于驗證其神經毒性的各種動物模型。
斑馬魚作為神經毒性研究體內動物模型的優勢：從遺傳學和發育生物學的基礎研究到人類疾病的治療應用和藥物發現，斑馬魚已被廣泛用作基本的動物模型。斑馬魚作為驗證新制造的化學品和納米材料毒性的強大模型系統引起了廣泛關注。
斑馬魚神經系統和神經化學：斑馬魚大腦的神經元組成、神經化學和代謝在人類和哺乳動物中高度保守。斑馬魚大腦發育過程中神經管在受精后12小時（hpf）開始形成，16 hpf可清晰區分前腦（端腦和間腦）、中腦（中腦）和后腦（菱形腦）。斑馬魚的大腦區域與人類大腦的新皮質、海馬和杏仁核類似，位于前腦皮層，主要負責認知、記憶功能以及恐懼和焦慮等情緒。下丘腦、韁核和松果體主要參與控制每一種感覺沖動、生殖行為和晝夜節律。
圖2.說明斑馬魚BBB、仔魚和成年腦的結構以及PSNP的神經毒性作用示意圖。
大腦通過神經遞質傳遞信號來處理各種生物活動所必需的信息，這些神經遞質充當每個神經元分泌的興奮劑、抑制劑和神經調節劑。興奮性神經遞質包括谷氨酸和乙酰膽堿，抑制性神經遞素包括甘氨酸和γ-氨基丁酸（GABA），單胺類神經遞質家族包括5-羥色胺、組胺和兒茶酚胺，包括多巴胺、腎上腺素（腎上腺素）和去甲腎上腺素。發育中的斑馬魚大腦中 GABA 能、谷氨酸能、5-羥色胺能和兒茶酚胺能神經元的分化非常迅速，幾乎在受精后 2-3 天 (dpf) 完成。斑馬魚在整個大腦中與哺乳動物和人類共享高度保守的神經遞質和神經元細胞，具有一定的區域特異性。
斑馬魚血腦屏障：血腦屏障（BBB）以高選擇性調節大腦和附近血管之間的聯系，由多種細胞類型組成，包括內皮細胞、星形膠質細胞末端足細胞和具有緊密連接的周細胞。斑馬魚的BBB在2.5至3 dpf之間開始形成，盡管在24–72 hpf之間的腦血管周圍和60 hpf后的周細胞周圍檢測到緊密連接的成分。將不同大小的熒光染料注入斑馬魚幼體的心包區域證明BBB的成熟是從3dpf到10dpf以時間依賴性的方式逐漸實現的。盡管斑馬魚BBB成熟完成的確切發育窗口尚未完全確定，但BBB功能在其他脊椎動物（包括小鼠）中保存良好。納米材料由于其納米尺寸、非典型形狀和其周圍具有各種特性的效應器而具有穿透血腦屏障的潛力。但目前尚不清楚ENM和NP是否通過結合特定受體的BBB或簡單地通過破壞組織而系統性地到達大腦。
評估納米材料對個體神經毒性的遺傳貢獻：為了研究特定環境下特定基因的功能、脆弱性和生物學機制，多年來斑馬魚基因敲除和敲入的基因組編輯技術不斷發展。CRISPR/Cas 系統已廣泛用于斑馬魚，將靶基因特異性單向導 RNA 和 Cas9 核酸內切酶的復合物注射到受精胚胎中，通過非同源末端連接或同源定向修復誘導感興趣基因的突變。
體內成像：生物監測染料和熒光轉基因系
斑馬魚的一項突出技術是利用生物監測染料或轉基因系染色進行體內成像。通過PTU（1-苯基-2-硫脲）處理或色素沉著突變體（如casper），可以在無色素沉著斑馬魚體內觀察動物深層組織中的細胞事件。抗體免疫染色、末端脫氧核苷酸轉移酶 dUTP 缺口末端標記 (TUNEL) 染色、氧化應激測量和原位雜交的成熟成像方案都適用于使用斑馬魚研究納米材料的神經毒性。盡管納米材料被證明能到達大腦，誘導神經細胞凋亡，破壞大腦發育/成熟，并在一些模型生物體中改變神經遞質。熒光轉基因斑馬魚系在納米材料的神經毒性研究領域尚未得到充分利用。這些品系可以成為一種強大的工具，以組織特異性的方式可視化分子或細胞的體內動力學并了解大腦功能，從而有助于在體內詳細研究納米材料在神經毒性中的多種效應。熒光標記的斑馬魚大腦可以通過采用顯微鏡技術包括共焦、光片和多光子顯微鏡，結合組織清除技術，在體內以單細胞分辨率成像。
斑馬魚 ENMs 和 NPs 的神經毒性研究：
TiO2-NPs 的神經毒性：為了驗證TiO2 NP誘導的神經毒性，用平均直徑為12nm的TiO2 NPs處理斑馬魚幼魚，在明暗交替刺激下表現出游泳速度和轉向行為能力降低。神經發生的 Nrd 和 Elavl3 和軸突生長的 alpha1-tubulin、mbp 和 gap43 的基因表達發生了顯著變化，而氧化應激的 Mn-sod、Cu/Zn-sod 和 Cat 基因沒有改變。Y-迷宮測試中臂訪問次數減少，TiO2 NP處理后證實c-fos、c-jun和bdnf基因表達增加，p38、NGF、CREB、NR1、NR2ab和GluR2表達減少。斑馬魚幼體模型還發現TiO2 NP處理后，帕金森病患者的運動行為活性降低、多巴胺能神經元丟失和與路易體形成相關的基因表達改變表明TiO2 NPP暴露在帕金森病的發病風險因素中起作用。
SiO2-NPs 的神經毒性：SiO2-NP 處理促進了抑郁表型，基于運動和探索行為參數，并改變了斑馬魚模型中免疫組織化學證實的酪氨酸羥化酶和血清素的表達。根據斑馬魚的發育階段以及SiO2 NP的大小、濃度和不同暴露時間，進行了PMR和VMR的神經毒性行為測試，一致顯示了用SiO2 NPs處理后斑馬魚胚胎和仔魚的行為反應變化。注射 SiO2-NP 的斑馬魚胚胎的微陣列分析表明與多巴胺、GABA、膽堿和神經肽受體的神經功能相關的基因表達顯著下調。發現 SiO2-NPs 暴露會改變帕金森病相關基因如 β-突觸核蛋白和 pink1 的表達。盡管上述神經毒性數據驗證了TiO2 NP和SiO2 NP的ENM影響了行為反應和與神經元功能相關的基因表達模式，但使用斑馬魚對具有不同物理化學性質的不同ENM進行神經毒性研究仍不足以揭示其確切作用和詳細的潛在機制。
PSNPs 在斑馬魚中的神經毒性：由于其非典型特征和小尺寸，PSNP可以通過BBB穿透包括大腦在內的器官，在細胞內細胞器中積累，與一系列蛋白質相互作用，并最終影響各種生物功能。幾項研究報告稱，PSNP在幾天內很容易在斑馬魚的大腦和其他器官中積累，并顯著影響該器官的功能。用于斑馬魚神經毒性分析的PSNP主要是直徑約為20-100nm的熒光聚苯乙烯顆粒，濃度范圍為0.1-100ppm。斑馬魚仔魚交替光刺激誘導的 VMR 反應已被用于多項研究來確定 PSNP 的行為神經毒性作用。 結果，主要通過 VMR 測試觀察到一些組活動減退，而另一組則相反多動癥。這種差異可能是由于實驗條件的差異造成的，例如PSNP的大小、濃度、暴露時間和斑馬魚的發育階段，因此需要進行更多的對照研究以了解PSNP確切的行為模式和影響。PSNP 處理的成年斑馬魚的各種行為包括社交互動、平均速度、探索行為、攻擊和捕食者回避、淺灘行為和晝夜節律都發生了改變表明PSNP會誘發行為神經毒性，盡管仍需要更多的研究來揭示PSNP與動物行為之間的聯系。由活性氧代謝中斷引起的氧化應激會對行為改變和發育過程產生不利影響，是PSNP誘發的主要事件之一。用氧化應激標記物8-OHdG抗體對斑馬魚胚胎腦組織的神經元細胞進行PSNP聚集區染色。暴露于 PSNP 后成年大腦中谷胱甘肽還原酶的活性降低，其在后代仔魚中的活性也比親代暴露組降低表明谷胱甘肽代謝是PSNP跨代的主要目標之一。PSNP誘導了除了仔魚和成蟲大腦外，包括胃腸道、肝臟和心臟各種組織的氧化應激。乙酰膽堿酯酶是一種催化乙酰膽堿水解來終止信號傳遞的酶，在最近的神經毒性研究中被提議作為生物標志物。即使在較低濃度下PSNP處理后，幼魚和成年斑馬魚大腦中的乙酰膽堿酯酶也有所降低。在特定情況下，某些基因突變可能會增加其神經毒性的脆弱性。轉基因斑馬魚允許識別和驗證體內更易受PSNP影響的基因突變。PSNP處理的野生型斑馬魚仔魚表現出活躍過度和應激激素皮質醇水平升高。
結論和展望：我們討論了 ENMs 和 PSNPs 作為代表性納米材料的一般特征，并回顧了對最近使用動物模型（特別是斑馬魚）的神經毒性。盡管進行了深入研究但對納米材料神經毒性的功能驗證和對其機制的理解仍然模糊不清。大量不斷合成和修飾的納米材料使得分析其神經毒性作用變得更加困難。斑馬魚作為一種合適的動物模型允許利用方便和有效的實驗方法包括轉基因系、敲除/敲入和一系列既定的行為測試，以及高分辨率成像來分析多種類型納米材料的神經毒性。斑馬魚將為體內納米毒性研究提供巨大的機會有助于理解神經毒性作用機制及開發更好更安全的納米材料。
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