TEL:17312606166（魏經(jīng)理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
摘要：腎臟在體液平衡和廢物排泄中起著至關(guān)重要的作用，腎損傷可對人類的健康和生存造成嚴重影響。大多數(shù)化學品，腎毒性潛力和相關(guān)機制尚不清楚。因此，需要對腎毒性化學品進行快速和靈敏的篩查。在文獻綜述的基礎(chǔ)上，評估了斑馬魚在化學誘導腎毒性和相關(guān)毒性模式研究中的效用。斑馬魚具有廣為人知的生物學特性，以及許多與哺乳動物重疊的生理特征。 其中一個特征是其腎臟，其組織學和功能與哺乳動物相似，但應(yīng)注意斑馬魚腎臟的獨特差異，例如腎骨髓。此外，斑馬魚腎結(jié)構(gòu)更簡單，易于觀察。由于這些優(yōu)勢，斑馬魚越來越多地被用作篩選化學品腎毒性和了解相關(guān)機制的實驗?zāi)Ｐ汀０唏R魚模型的多個終點，從功能水平（即腎小球濾過）到關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄變化已被評估以確定化學誘導的腎臟毒性并闡明潛在的機制。斑馬魚化學誘導腎毒性的最常見研究機制包括氧化應(yīng)激、炎癥、DNA損傷、凋亡、纖維化和細胞死亡。迄今為止，已證明幾種藥物、氧化劑、天然產(chǎn)物、殺菌劑、酒精和消費化學品對斑馬魚產(chǎn)生不同類型的腎臟毒性。本綜述表明斑馬魚模型可以有效地用于快速可靠地評估化學品的腎臟損傷潛力以及相關(guān)的毒性機制。從該模型獲得的毒理學信息可用于鑒定腎毒性化學品，從而保護公眾健康。
關(guān)鍵詞：腎毒性 斑馬魚 高通量 篩選 化學品安全
摘要：腎臟是負責維持體液內(nèi)穩(wěn)態(tài)和排泄包括人類在內(nèi)的脊椎動物體內(nèi)廢物的重要器官。腎臟疾病和化學品：腎臟疾病會嚴重威脅人類的福祉和生存，因此被認為是重大的公共衛(wèi)生問題之一。急性腎損傷（AKI）是一種以腎小球濾過率（GFR）突然下降或血清肌酐水平升高為特征的急性疾病。腎灌注障礙或減少、腎小球腎炎或毒素（如抗生素和幾種化學物質(zhì)）可能導致急性腎損傷。另一方面，慢性腎病（CKD）被定義為腎功能逐漸退化，最終導致腎功能衰竭。CKD是普通人群中普遍存在的慢性疾病。流行病學證據(jù)越來越多地支持化學物質(zhì)參與急性和慢性腎臟疾病的發(fā)生和進展。食用受三聚氰胺污染的牛奶的兒童患上腎結(jié)石，其中2.5%的兒童隨后成為急性腎功能衰竭的受害者。三聚氰胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰酸對腎臟的特征性損害已在其他幾項流行病學研究中得到進一步驗證。體內(nèi)試驗也用于腎毒性評估，大多數(shù)體內(nèi)方法涉及嚙齒動物模型，包括嚙齒動物的重復28 天經(jīng)口毒性研究。可用于高通量篩選腎毒性的標準化測試方法是有限的。由于斑馬魚腎臟易于觀察并且具有與哺乳動物非常相似的生理特征，因此斑馬魚已被建議作為一種替代實驗?zāi)Ｐ陀糜诳焖倏煽康睾Y選腎毒性化學物質(zhì)及了解相關(guān)機制。例如，可以很容易地觀察到斑馬魚胚胎幼體的前腎結(jié)構(gòu)或功能變化，因此可以用于快速可靠地評估化學誘導的腎毒性。另一方面，成年斑馬魚的中腎結(jié)構(gòu)更復雜，已被用于藥物或化學物質(zhì)引起的腎毒性的機理研究。
用于腎毒性評估的斑馬魚模型：作為淡水魚，維持液體滲透壓對斑馬魚的生存至關(guān)重要。在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中，前腎發(fā)育在受精后約 48 小時 (hpf) 完成。中腎在幼年階段逐漸發(fā)育。斑馬魚的腎臟比人類的腎臟結(jié)構(gòu)簡單。與人類相似，斑馬魚的腎臟包含腎小球、頸部、近端小管、遠端小管和集合管。在幼齡斑馬魚中，前腎是能夠調(diào)節(jié)滲透壓的功能性腎臟。.前腎由兩個腎單位組成，前腎管與哺乳動物的近端和早期遠端小管相當。與哺乳動物不同，斑馬魚的前腎沒有細支和粗上升支結(jié)構(gòu)。成年斑馬魚具有中腎結(jié)構(gòu)，但與人類不同，它不會發(fā)育成后腎。斑馬魚的腎臟與哺乳動物的腎臟有幾個明顯的不同：斑馬魚和所有硬骨魚類一樣，缺乏骨髓和淋巴結(jié)，其造血發(fā)生在腎骨髓中，腎骨髓的功能相當于哺乳動物的骨髓。斑馬魚腎臟損傷也會影響免疫功能。此外，斑馬魚的腎臟在受傷后可以再生。這與哺乳動物腎臟不同，后者的損傷通常被認為是不可逆轉(zhuǎn)的。 當斑馬魚用作腎毒性模型生物以推斷或轉(zhuǎn)化人類結(jié)果時應(yīng)仔細考慮這些特征差異。盡管存在這些差異，斑馬魚作為腎臟毒理學實驗?zāi)Ｐ途哂袔讉€獨特的優(yōu)勢。 腎功能相似是斑馬魚最重要的優(yōu)勢之一。：腎小球過濾血液，腎小管段排泄或重吸收溶質(zhì)和水，集合管將尿液排出體外。與人類和其他哺乳動物相比，斑馬魚腎臟的腎單位片段模式和細胞組成更容易獲得和觀察。此外，隨著對替代試驗方法的需求增加，胚胎-仔魚斑馬魚模型被認為是一種有用的模型，可以補充現(xiàn)有的體外實驗?zāi)Ｐ汀Ｅ咛テ诤陀左w期斑馬魚被認為是一種快速腎毒性評估篩選模型。成年斑馬魚被認為對機制研究更有用，更容易獲得器官或組織特異性反應(yīng)。此外，斑馬魚導致腎臟毒性的主要途徑的基因，例如細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥，以與人類相似的方式表達。斑馬魚已被用作評估化學誘導腎毒性的實驗?zāi)Ｐ汀８鶕?jù)文獻綜述，評估了斑馬魚在研究化學性腎毒性和研究毒性模式方面的效用。
腎毒性評估的觀察終點：為了評估化學誘導的腎臟毒性和相關(guān)機制，許多觀察終點已應(yīng)用于斑馬魚模型。這些可以根據(jù)生物學水平（如功能、組織學、分子、蛋白質(zhì)和基因）的觀察終點進行分類。
圖 1. 斑馬魚不同生命階段測量到的化學性腎損傷。胚胎、仔魚和成年斑馬魚暴露于化學品后的形態(tài)、功能、組織學、細胞、分子或轉(zhuǎn)錄水平變化。
腎臟濾過功能改變：濾過是腎臟在腎小球中的一項基本功能，已被用于評估腎臟的功能損害。采用了直接和間接方法測量斑馬魚腎小球濾過的變化。直接測量包括測量腎清除的標志物。標記間隙減小被認為是濾過功能受損。熒光標記的葡聚糖或菊糖是最常用的標記物質(zhì)。將這些標記物微量注射到斑馬魚心臟，并隨時間推移通過熒光顯微鏡量化標記物的腎臟清除率。許多研究中使用了不同的標記：異硫氰酸熒光素（FITC）標記的右旋糖酐用于測量腎小球濾過強度。羅丹明標記的葡聚糖方法用于測量腎小球濾過強度。斑馬魚模型使用直接方法測量的過濾功能改變提供了化學誘導的腎臟毒性的直接指示。直接測量功能變化需要熟練的操作，例如，將熒光物質(zhì)微量注射到非常微小的斑馬魚胚胎或幼體中。如果仔細應(yīng)用，幼魚可用于高通量篩選。將斑馬魚的觀察結(jié)果轉(zhuǎn)化為人類結(jié)果應(yīng)考慮斑馬魚和哺乳動物腎臟之間的結(jié)構(gòu)差異，例如缺少細支段、粗升支和膀胱。由于結(jié)構(gòu)差異可能導致功能差異，因此可能需要額外的證據(jù)來將斑馬魚的觀察結(jié)果與哺乳動物的潛在腎臟結(jié)果聯(lián)系起來。，尿液中排出的過量蛋白質(zhì)已被作為腎功能的間接測量。因為大分子如蛋白質(zhì)的存在可能表明腎小球不能過濾和維持循環(huán)中的大分子。通過量化暴露后水中的蛋白質(zhì)間接測量斑馬魚的蛋白尿。該方法的有效性可能會受到介質(zhì)潛在外部污染的挑戰(zhàn)，例如飼料或排泄物。還使用了轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型測量腎臟的功能變化。在轉(zhuǎn)基因斑馬魚中測量了綠色熒光蛋白 (GFP)，作為蛋白尿和維生素 D 結(jié)合蛋白 (VDBP) 的間接示蹤劑，這是與哺乳動物白蛋白最接近的同源物。雖然轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型可能會在未來取代更多勞動密集型的傳統(tǒng)方法但迄今為止只有少數(shù)研究采用了轉(zhuǎn)基因模型。
形態(tài)和組織學變化：斑馬魚腎臟的一些形態(tài)學變化已被用作腎臟毒性的終點。包括腎小球、前腎小管和導管的形態(tài)學改變。 此外，據(jù)報道，在暴露于多種化學物質(zhì)后會出現(xiàn)腎水腫或腎積液。具有特定組織熒光標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型也已用于證明腎臟的形態(tài)變化。例如，斑馬魚Tg（wt1b:GFP）模型用綠色熒光標記腎小球、前腎小管和導管，并檢查其形態(tài)變化。轉(zhuǎn)基因斑馬魚，如 Tg(PT:EGFP)、Tg(wt1b: GFP) 和 NTR-mCherry 模型分別用于評估近端小管、前腎管和足細胞缺陷的結(jié)構(gòu)變化。使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型可以直接觀察腎臟的結(jié)構(gòu)變化，即使在生命的早期階段也是如此。與野生型斑馬魚相比，轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型有一些局限性，例如難以飼養(yǎng)到成年階段，以及生命階段之間的遺傳或結(jié)構(gòu)差異。許多研究測量了斑馬魚作為化學品腎毒性標志物的腎小球、腎小管或?qū)Ч艿奶囟ńM織病理學變化。組織學觀察通常采用石蠟固定和染料染色或免疫組織化學方法。 已報道腎小球足細胞的囊腫形成和組織學變化。已評估了腎小管血液積聚、管腔擴張、溶酶體磷脂病和其他異常或雜亂形狀的腎小管、囊腫和間充質(zhì)細胞。
細胞和分子標記：在細胞水平上，細胞凋亡或壞死被用來證明化學暴露的腎毒性和相關(guān)機制。TUNEL 試驗已用于顯示腎小球或腎小管細胞的凋亡。Pax2a是一種在某些哺乳動物AKI模型中損傷后重新激活的轉(zhuǎn)錄因子，在暴露于這種腎毒性藥物后，Pax2a被證明存在于斑馬魚仔魚的近端小管中。Bax/Bcl2 比率的增加也用于指示斑馬魚的促細胞凋亡。通過激活聚ADP核糖聚合酶（PARP）或使用細胞死亡檢測試劑盒檢測腎細胞死亡。測量了幾個分子終點以指示腎臟中的氧化應(yīng)激。量化斑馬魚腎臟中的過氧化氫酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶以及活性氧化物種（ROS）的增加以表明暴露于三氧化二砷和微囊藻毒素LR等化學物質(zhì)后，腎臟發(fā)生氧化損傷。脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物，例如硫代巴巴多斯酸反應(yīng)物質(zhì)（TBARS），也可以用作氧化應(yīng)激的生物標記物。斑馬魚幼體中嘌呤、谷胱甘肽和氨基酸（腺苷、肌酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、鳥苷、次黃嘌呤、酪氨酸、黃嘌呤）的代謝產(chǎn)物可能與暴露于某些藥物引起的腎小管損傷有關(guān)。
其他細胞損傷的分子標記物已用于評估腎毒性。例如，順鉑誘導的DNA損傷標記物γH2AX增加。由于這些標記物中的許多并非僅在腎臟中特異表達，因此通常在分離的腎組織中測量這些標記物以支持腎毒性：示例包括在斑馬魚腎臟中定量組蛋白變體H2AX（γH2AX）的磷酸化Ser-139殘基，這是一種DNA損傷標記。腎小管中的免疫染色定量α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），肌成纖維細胞標記物。細胞和分子標記都可用于填補轉(zhuǎn)錄和形態(tài)觀察之間的空白，并可能提供機制理解和與不良腎臟結(jié)果相關(guān)的證據(jù)。
基因的轉(zhuǎn)錄變化：已經(jīng)提出與腎毒性相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄變化來篩選和闡明化學誘導的腎毒性的機制。經(jīng)常使用與正常腎功能和腎發(fā)生相關(guān)的基因。 Nephrin 編碼一種蛋白質(zhì) nephrin，它是腎小球濾過屏障的重要組成部分，用于破壞腎小球濾過屏障。與胚胎斑馬魚的腎臟發(fā)育相關(guān)的 wt1a 和 wt1b 被用來暗示腎臟發(fā)育異常：這些基因在暴露于化學物質(zhì)（例如阿霉素）后發(fā)生轉(zhuǎn)錄變化。cadherin-17 (cdh17) 基因是腎臟發(fā)育的另一個標志物。在暴露于氯化鎘和赭曲霉毒素 A 后，在斑馬魚仔魚中觀察到 cdh17 的下調(diào)。腎損傷分子-1（kim-1）是一種不僅在人類中而且在斑馬魚中編碼kim蛋白的基因。KIM蛋白是一種上皮吞噬細胞受體，經(jīng)常用于指示腎小管損傷。因此，kim-1 基因的上調(diào)可以解釋為 AKI 的一個指征。注射慶大霉素后，斑馬魚幼體中kim-1基因表達上調(diào)。雖然已知kim-3和kim-4基因在斑馬魚中表達，但kim-1（kim1-s和kim1-l）通常是首選標記，因為該基因主要在腎臟而不是其他器官中表達。腎損傷標記基因的調(diào)控類型和模式因化學物質(zhì)而異，這表明這些標記基因的調(diào)控變化模式可用于闡明或區(qū)分不同化學物質(zhì)的腎毒性模式。因為成年斑馬魚腎臟的分離更容易所中更頻繁地測量到基因轉(zhuǎn)錄的組織特異性改變。胚胎仔魚腎臟的分離不容易完成，因此通常使用全身勻漿進行測量。其他終點與胚胎仔魚觀察一起測量，以支持腎毒性的可能性。
化學性腎毒性的主要機制：斑馬魚化學誘導腎毒性的主要機制包括但不限于細胞凋亡、細胞死亡、纖維化、炎癥和氧化應(yīng)激。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，是生物體維持的重要機制，但它可能導致急性和慢性毒性：過度的細胞凋亡可能導致細胞萎縮，并可能導致纖維化，最終導致腎功能障礙。因此，細胞凋亡被認為是腎損傷的重要機制之一。成年雌性斑馬魚在暴露于微囊藻毒素 60 天后腎臟樣本發(fā)現(xiàn)典型的腎毒素凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)變化，例如 bcl-2、bax、bid、caspase-3、caspase-8 和 caspase-9 -LR。腎細胞死亡可能導致腎功能損害和腎損害。例如，接觸中藥馬錢子后熒光顯微鏡觀察到腎細胞死亡。接觸順鉑的斑馬魚腎臟中也檢測到細胞死亡標記物聚ADP核糖聚合酶（PARP）。使用 5-溴-2-脫氧尿苷 (BrdU) 標記來測量轉(zhuǎn)基因斑馬魚 (Tg(podocin:NTR-GFP))腎損傷的恢復--足細胞的增殖情況。雖然最終可能導致斑馬魚死亡，但斑馬魚腎臟中的細胞死亡可以暫時恢復：這就是為什么在成年斑馬魚模型或長期暴露模型中無法輕易觀察到細胞死亡的原因。 DNA損傷是細胞死亡的原因之一。在斑馬魚中，通過western blotting測定DNA損傷標記物γH2AX，以確定順鉑暴露的腎毒性。纖維化是導致腎損傷的主要機制。在嚙齒動物中證明了馬兜鈴酸誘導腎纖維化。斑馬魚腎臟毒性機制的纖維化尚未得到很好的描述：馬兜鈴酸暴露既不影響肌成纖維細胞標志物 α-SMA，也不改變纖維化標志基因的轉(zhuǎn)錄，例如 col4a1、fn1a、acta2、tgfb1a、 腫瘤壞死因子基因。與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的vim基因和與EMT誘導劑相關(guān)的mmp9基因的上調(diào)表明斑馬魚也可能發(fā)生腎纖維化。炎癥是另一種與腎毒性有關(guān)的現(xiàn)象。炎癥可能導致器官衰竭。炎癥主要由先天免疫細胞介導是一種正常的生理過程，可以清除受損或壞死的細胞，在腎臟中觀察到的炎癥相關(guān)指標可用于提示化學暴露引起的急性腎損傷。促炎標志物，例如 cox1、cox2、cox2a、il-1β、il-6、tnfα 和 mpo 基因用于評估斑馬魚胚胎的炎癥損傷。胚胎仔魚炎癥標記物通常整體測量，可能并不代表腎臟特異性損傷。可以相對容易地分離幼年或成年斑馬魚腎臟，因此，可以測量炎癥標記物的腎臟特異性變化并將其用作闡明化學誘導腎毒性機制的一個有希望的工具。
氧化應(yīng)激是另一種經(jīng)常研究的機制，可以解釋化學誘導的腎毒性。 據(jù)報道，許多化學品或藥物會產(chǎn)生 ROS 并導致腎臟功能改變。暴露于腎毒物后，斑馬魚體內(nèi) ROS 和抗氧化酶活性增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 應(yīng)激可能是斑馬魚中一種重要的化學誘導毒性機制，盡管沒有實驗研究表明斑馬魚中的 ER 應(yīng)激。ER負責蛋白質(zhì)翻譯后的蛋白質(zhì)折疊和分選， ER應(yīng)激可能導致蛋白質(zhì)未折疊或折疊不當最終導致功能異常。熱休克反應(yīng) (HSR) 與化學誘導的腎毒性有關(guān)。
圖2、不同類型化學品引起腎毒性的主要機制。
結(jié)論：環(huán)境化學物質(zhì)是腎病的重要危險因素。本文展示了斑馬魚作為化學誘導腎毒性的實驗?zāi)Ｐ偷男в谩８鶕?jù)現(xiàn)有文獻信息總結(jié)了已經(jīng)或可以在斑馬魚中評估的主要觀察終點和腎毒性模式。雖然斑馬魚模型存在一些局限性，例如，不同生命階段不同的腎臟類型，可影響免疫功能、再生能力的腎骨髓和仔魚腎臟分離困難，在研究化學暴露引起的腎毒性和損傷方面斑馬魚是一種很有前景的實驗?zāi)Ｐ汀Ｅ咛?仔魚斑馬魚可以為腎臟毒物化學物質(zhì)提供高效快速的篩查措施。成年斑馬魚模型可用于測量腎臟特異性標記物，從而對化學誘導的腎毒性進行最終確認和機制評估。
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