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摘要：CRH 神經元釋放的促腎上腺皮質激素釋放激素 (CRH)能激活下丘腦-垂體-腎上腺 (HPA) 軸，主要的生理應激反應系統之一。 HPA 軸上運行復雜的反饋回路，了解在應激障礙背景下調節 CRH 神經元的神經生物學機制非常重要。我們回顧了斑馬魚體內研究如何提高 CRH 神經元的神經生物學知識。精神分裂癥1(DISC1) 突變斑馬魚減弱了應激反應，可用于模擬人類應激障礙。我們認為與精神疾病的機制聯系得DISC1影響CRH神經元的發育和功能。

研究CRH軸的斑馬魚模型：促腎上腺皮質激素釋放激素 (CRH)，也稱為促腎上腺皮質激素釋放因子，是一種 41 個氨基酸肽。雖然在身體許多部位的不同組織中產生，但 CRH 研究最多的是它作為一種釋放激素參與下丘腦-垂體-腎上腺 (HPA) 軸介導的應激反應。當應激源激活HPA軸時，CRH從投射到正中隆起的下丘腦室旁核（PVN）的小細胞神經元釋放；CRH 進入門靜脈系統并通過小毛細血管運輸到垂體前葉。魚類HPI 軸激活誘導神經分泌視前區 (NPO) 的神經元分泌 CRH。這些細胞將直接的神經元投射發送到垂體前葉的遠端。在垂體前葉的促皮質激素細胞中，CRH 與其受體結合。魚類和哺乳動物中都存在兩種受體，CRH受體1和CRH受體2（分別為CRHR1和CRHR2），CRHR1是魚類HPI軸的主要受體。受體結合啟動促腎上腺皮質激素（ACTH）的合成和釋放，促腎上腺皮質素通過循環到達腎上腺或內分泌腺。ACTH 與腎間腺的類固醇生成細胞中的受體 MC2R（黑皮質素 2 受體）結合從而啟動皮質醇的合成，皮質醇是魚類和人類的關鍵應激激素。

小鼠損傷和遺傳學研究表明CRH神經元對應激反應至關重要。然而，哺乳動物下丘腦位于大腦深處，很難進入限制了此類研究。斑馬魚的大腦要小得多，適合進行體內神經生理學實驗。斑馬魚為研究支持行為表型的神經發育和神經生理學機制提供了一個遺傳易處理的高通量系統。將討論斑馬魚 CRH 系統，重點關注下丘腦 CRH 神經元。 此外，我們討論了 CRH 與精神分裂癥 1 (DISC1) 的相互作用，動物模型表明 CRH 系統發生了改變。

斑馬魚下丘腦的CRH神經元：斑馬魚 CRH 神經元分布在整個大腦中以相當保守的方式分布。 哺乳動物CRH 由單個基因編碼以相當保守的方式分布。 硬骨魚兩個 CRH 基因 crha 和 crhb 通過基因組復制進化。crha和crhb基因分別編碼162和132個氨基酸多肽具有44%的同一性和56%的相似性。crhb被認為是哺乳動物CRH基因的同源基因，其研究范圍比crha廣泛得多，crha的表達僅限于腦室周圍下丘腦。crhb首先在受精后24小時左右（hpf）表達，從受精后3天起（dpf）可以在大腦的多個區域檢測到，包括丘腦下部、視前區、后結節、下丘腦、腹側丘腦和后腦以及視網膜。在斑馬魚的NPO中發現視前區crh表達神經元。該區域內表達 crh 的神經元與其他表達催產素 (oxt)、精氨酸加壓素 (avp)、腦啡肽原 a (penka)、神經降壓素 (nts) 和生長抑素的神經元形成密集的混合簇。而表達膽囊收縮素 (cck)、腦啡肽原 b (penkb) 和血管活性腸肽 (vip) 的神經元則位于不同的 NPO 亞區。 NPO 之外可以在下丘腦的其他區域特別是在結節區域發現表達 crh 的細胞，小鼠也是如此。

魚類的功能研究支持NPO的CRH神經元在應激調節中的作用：在斑馬魚身上的研究揭示了NPO的CRH神經元在完整動物體內對急性應激暴露的反應。響應性CRH NPO細胞的數量也隨著應激強度的增加而增加，并且這些細胞還表現出Ca2+增加。數據表明，CRH細胞活動受到嚴格調控并根據應激源強度而變化以確保HPA軸反應與威脅嚴重程度成比例。隨后的一項研究利用分子、成像和計算技術研究了各種NPO神經肽在應激行為反應中的作用。與其他一些NPO肽能群體相比表達crh的神經元在對特定威脅的反應方面表現出專業化。例如，許多表達crh的神經元純粹對熱、鹽度或酸度做出反應，而不是對多種威脅做出反應。雖然消融 crh 或 oxt 的表達神經元對威脅的行為反應沒有影響，但兩者的聯合消融顯著降低了對厭惡刺激的行為反應，這表明這些單獨的神經元簇共同作用以促進應激誘導行為。隨后的實驗表明，表達oxt和crh的NPO簇在很大程度上是谷氨酸能的，除了投射到垂體外，還投射到腦干中一組特定的脊髓投射神經元，這對應激運動反應至關重要。在很短的時間內觀察到對厭惡性刺激的行為反應，這表明CRH NPO神經元在對各種應激源的快速運動反應中發揮作用。使用 CRISPR crhr1 敲除 (KO) 斑馬魚在體內研究了 CRH 系統。crhr1 KO 仔魚無法對急性應激源做出反應，即內源性皮質醇水平在應激暴露后并沒有像在野生型中觀察到的那樣迅速增加。在明暗運動試驗中crhr1 KO仔魚也表現出行為改變，通常在明暗期凍結，在黑暗期自由游泳。在黑暗階段crhr1 KO 仔魚在 15 分鐘和 60 分鐘時間點與野生型相比表現出一些低活性。在光照階段，應激暴露誘導野生型仔魚過度活躍，但在crhr1 KO仔魚中未觀察到這種情況。然而，進一步的實驗表明，應激誘導的多動癥可能主要由皮質醇的下游效應而不是CRH本身介導。對該模型的進一步研究可能揭示CRH是否獨立于皮質醇調節魚類的其他應激誘導行為，正如在嚙齒動物中觀察到的那樣。

應激反應中CRH表達的調節：CRH的調節對于建立適當的應激反應至關重要。斑馬魚實驗表明，含有同源結構域的Otp參與應激反應期間crh的轉錄調節。斑馬魚有兩種 OTP 同源物，即 otpa 和 otpb。 otpa null斑馬魚在急性應激源暴露后不會上調crh表達。染色質免疫沉淀（ChIP）實驗隨后顯示在暴露于應激源后Otp蛋白被招募到斑馬魚crh啟動子區域。以類似的方式，Otp 在應激后也被招募到 a2bp1 基因的啟動子區域。已知 RBFOX1 可調節神經元 Pac1 的可變剪接，后者編碼垂體腺苷酸環化酶激活肽的受體。作者證明了短 pac1 變體是應激后 crh 轉錄正常上調所必需的，而 pac1-hop (long) mRNA 同種型是應激后恢復階段 crh 轉錄正常終止以及內源性皮質醇的初始和恢復階段正常調節所必需的。發現斑馬魚仔魚pac1-hop（長）變體對于急性應激源的行為反應非常重要。這些實驗支持了pac1的選擇性剪接對于應激誘導的crh轉錄、HPA軸和行為的調節是必需的。除了在HPI軸調節的背景下鑒定似乎能急性調節crh表達的分子外，動物模型還可用于鑒定可能調節crh神經元發育的分子，而這些分子又可能影響其在HPA軸的功能。嚙齒動物的經典敲除研究已經確定了參與 CRH 神經元發育調節的多個參與者。斑馬魚研究還發現了一些正在開發的新型crh潛在調節因子。趨化因子樣基因 sam2 (samdori 2) 的斑馬魚突變體在新型水箱和淺灘試驗測試中表現出焦慮樣行為，并且視前區的 crh 表達顯著增加。Sam2 KO小鼠也表現出焦慮和恐懼行為，在PVN中Sam2似乎調節CRH神經元上GABA能輸入的頻率。

人類應激障礙的斑馬魚模型：CRH-DISC1連接

描述人類應激障礙的最佳斑馬魚模型之一是DISC1（精神分裂癥1中的紊亂）斑馬魚。DISC1編碼一種多功能支架蛋白，顯示出大量的蛋白質-蛋白質相互作用。有證據表明DISC1是一系列精神疾病的危險因素，并在神經發育和神經信號通路中發揮作用。盡管 DISC1 與更廣泛人群中的精神疾病的相關性仍然存在爭議，但 DISC1 突變體和轉基因小鼠作為人類精神疾病模型具有表面有效性從而使人們了解精神疾病的病理生理機制。Disc1突變小鼠表現出廣泛的行為和神經表型。其中包括HPA軸缺陷，表現為應激反應的改變。在攜帶可誘導突變人DISC1基因的轉基因小鼠株中報道了HPA軸的反應性減弱。在第二項研究中，報告了一種相反的表型：輕度隔離應激攜帶突變人DISC1基因的青少年轉基因小鼠后發現血漿皮質酮水平升高。這些明顯相互矛盾的結果可能反映了使用不同應激模式、使用不同啟動子的突變人DISC1表達譜或在HPA軸上運行的復雜反饋環的差異。在胚胎斑馬魚中，在腹側間腦（包括下丘腦結節）disc1表達顯著。表達disc1的細胞靠近表達crh的神經元，以及表達nr5a1a和pomca的神經元。純合disc1突變體改變了下丘腦結節中crh的表達，視前下丘腦中crh表達也改變。disc1 突變的影響在生命早期是動態的：在胚胎期，在視前 NPO 區域觀察到 crh 表達增加而 disc1 突變體仔魚下丘腦中 crh 表達降低。仔魚階段crh表達神經元的減少與突變仔魚對急性應激暴露的遲鈍行為和內分泌反應相關，這與先前描述的HPA軸反應性減弱一致。鑒于 crh 在應激調節中的重要作用以及 disc1 突變斑馬魚應激反應的改變，disc1 似乎 通過 crh 調節 HPA 軸。disc1調節下丘腦crh神經元發育的機制尚不清楚。此外，disc1突變體顯示表達pomca和nr5a1a的神經元分化發生改變。到目前為止導致disc1突變體中crh表達神經元數量改變的機制尚不清楚。迄今為止沒有對斑馬魚rx3基因敲除后的rx3表現祖細胞進行譜系分析也沒有對crh表現神經元進行全面分析。disc1可通過作用于已知的crh調節因子之一，如otp、arnt2和sim1a、brn2或LIM同源框2（lhx2）或通過未知途徑調節crh神經元的發育。disc1 可以通過作用于已知的 crh 調節因子之一，如 otp、arnt2 和 sim1a、brn2 或 LIM 同源框 2 (lhx2) 或通過尚不清楚的途徑來調節 crh 神經元的發育。

Disc1對斑馬魚下丘腦發育的調節

未來展望：最近對斑馬魚的研究表明應激反應中CRH神經元的活動是復雜的，受到嚴格的調節，CRH 神經元活動的不同方面會隨著威脅性刺激而變化。使用體內鈣成像等技術測量斑馬魚的神經元活動是梳理完整動物 CRH 神經元復雜功能的有力工具。在有或無應激源暴露的disc1突變魚中進行鈣成像，可以深入了解disc1是否在體內調節CRH神經元的活動。在不同環境（例如早期生活壓力暴露）下飼養的動物的 CRH 神經元的鈣成像可以揭示發育如何影響應激反應。哺乳動物的單細胞 RNA 測序 (scRNAseq) 研究表明即使在視前區域內也存在多個下丘腦 Crh 表達細胞亞群。斑馬魚是一種具有較小的大腦的簡單模型生物，但具有高度的分子保守性可用于研究這些小細胞群的發育和功能。disc1 突變魚 crh 表達細胞的 scRNAseq 可用于梳理由于 disc1 功能缺乏導致的 CRH 神經元特定的亞群差異以及鑒定連接disc1與CRH神經元發育和功能的分子。

原文出自：Zebrafish as a model to investigate the CRH axis and interactions with DISC1 - ScienceDirect