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摘要：硒是一種從日常飲食中提取的必需微量營養素，可維持脊椎動物的正常生長發育。過量攝入硒會導致心血管毒性、生殖毒性和神經毒性。然而，很少有人研究硒對神經發育和運動行為的毒性作用。在這項研究中，用硒處理新受精的斑馬魚胚胎。0.5μM濃度的硒處理降低了斑馬魚胚胎的移動速度和距離，并減弱了觸摸反應。TUNEL 測定和免疫熒光分析表明，硒可誘導神經系統損傷，包括促進細胞凋亡、增殖和神經炎癥，并減少斑馬魚胚胎中的神經元。RNA-seq 和 RT-PCR 結果表明，硒處理顯著降低了斑馬魚胚胎中多巴胺能神經元、運動神經元、GABA 能神經元和神經遞質轉運標記基因的表達。在硒處理的胚胎中，PPAR信號通路標記基因的表達顯著下調。測試了兩種 PPAR 激動劑（羅格列酮和苯扎貝特）和一種抗癌藥物（順鉑）在減輕硒誘導的運動缺陷方面的作用。羅格列酮和苯扎貝特可以恢復一些神經標記基因的表達，但不能完全挽救硒誘導的運動行為缺陷。 補充順鉑可將功能失調的運動行為和PPAR和神經標記基因的異常表達恢復到幾乎正常水平?？傊?，本研究結果表明，硒誘導的神經發育和運動行為缺陷是由包括PPAR信號在內的多種復雜因素引起的，所有因素都可能通過未知機制被順鉑恢復。

關鍵詞：硒  斑馬魚  神經發育   運動行為

簡介：硒通常被認為是一種具有抗氧化和抗炎作用的微量元素。然而，最近的研究表明，過量硒對包括魚類、水生鳥類和兩棲動物在內的脊椎動物有一定的毒性作用，這在包括美國、中國、加拿大和印度在內的許多國家都有報道。硒主要存在于自然環境中的煤、地殼巖石和磷酸鹽土壤中。人類活動加劇了水環境中的硒污染，如采礦、煉油、發電、農業排水和含硒土壤上的畜牧業。在受硒污染的水環境中，硒的濃度通常在10μg L-1到68.7μg L-1（0.13–0.86μM）之間，遠高于安全濃度。硒過量攝入會對脊椎動物的神經、免疫、心血管和生殖系統造成損害。我們之前的研究表明，硒蛋氨酸的積累可以延遲孵化并導致斑馬魚胚胎出現一系列畸形。也有報道稱，膳食中補充硒代蛋氨酸可以改變成年斑馬魚的社交和抗驚厥行為。硒的毒性作用可能是由于其產生活性氧（ROS）的能力。 雖然中等濃度的硒具有一定的抗氧化作用，但過量的硒會破壞氧化還原平衡。例如，之前的一項研究報告稱，胚胎中微量注射硒可以改變氧化反應轉錄因子的基因表達。一些研究表明，硒可以預防由多種重金屬和污染物（如氯氰菊酯、甲基汞和鎘）引起的神經毒性。然而，關于過量硒的神經毒性的研究很少。正常的運動行為需要神經系統和肌肉收縮的綜合功能，而從神經系統釋放信號刺激肌肉收縮是主要原則，從無脊椎動物到包括哺乳動物在內的脊椎動物都是如此。多巴胺能神經元和運動神經元是與運動行為相關的兩種主要神經細胞類型。 多巴胺能神經元負責釋放多巴胺作為一種神經遞質以支持正常的運動功能。據報道，運動神經中樞多巴胺能神經元的損傷導致帕金森病。運動神經元負責將中樞神經信號傳輸到肌肉并支配其活動。 運動神經元的損傷也會導致各種神經系統疾病，包括原發性側索硬化、肌萎縮側索硬化和進行性延髓麻痹。此外，從神經元到神經元以及從神經元到效應細胞的信息傳遞依賴于神經遞質，例如乙酰膽堿、γ-氨基丁酸 (GABA)、多巴胺和5-羥色胺。因此，維持正常的神經遞質傳遞對于正常的運動行為也是必不可少的。神經系統，特別是斑馬魚胚胎和仔魚的神經系統，很容易受到外界環境的影響。 接觸污染物和藥物容易影響神經系統發育，損傷神經細胞，導致運動能力缺陷。據報道，硒對5-羥色胺能神經傳遞和多巴胺能神經系統有重要影響，影響成年斑馬魚的社交和學習能力。此外，已經發現過量的硒會誘導秀麗隱桿線蟲的膽堿能運動神經元變性。然而，關于斑馬魚胚胎中過量硒引起的功能障礙運動行為的研究仍然很少。 過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPAR) 是一種非甾體核受體，在多種細胞類型和組織中表達并且在配體特異性和代謝途徑激活方面表現出差異。研究表明，PPARs參與神經系統的發育和功能，激活PPARs可以有效緩解神經功能障礙，提高運動能力。我們推測過量的硒可能通過破壞斑馬魚胚胎的早期神經發育來影響運動行為，而 PPAR 信號可能與硒誘導的行為缺陷有關。首先檢測胚胎的觸覺反應和運動行為，然后檢測大腦細胞的形態特征、凋亡和增殖。然后，通過qPCR和免疫熒光（IF）評估斑馬魚胚胎發生過程中神經特異性細胞標記物的表達，如神經膠質細胞、多巴胺能神經元、GABA能神經元、運動神經元和神經遞質傳遞。此外，還測試了兩種PPAR（過氧化物酶體增殖物激活受體）激動劑羅格列酮和苯扎貝特緩解硒誘導的運動缺陷的效果。順鉑是一種廣泛使用的抗癌藥物，通常被認為具有細胞毒性。然而，我們之前的研究表明，低劑量順鉑可以有效緩解硒誘導的眼部發育缺陷。因此，順鉑也被添加到硒處理的胚胎中以試圖挽救硒誘導的運動缺陷。

圖 1 、硒暴露對96 hpf斑馬魚仔魚運動行為的影響。 對照、0.125?μM、0.25?μM 和 0.5?μM 硒處理組斑馬魚仔魚的移動軌跡 (A)、距離 (B) 和速度 (C)。

硒誘導斑馬魚運動行為功能失調：為了驗證運動行為缺陷的有效硒濃度窗口，受精斑馬魚胚胎暴露于不同濃度（0.125、0.25、0.5和1?μM）的硒中。然后，在對照組和硒處理組中檢測表型、死亡率和孵化率。隨著硒濃度的增加，胚胎死亡率增加，孵化率降低。當硒濃度達到1?μM時，近50%的胚胎死亡，存活的胚胎也出現嚴重畸形。選取各組（對照組，0.125、0.25和0.5?μM）無明顯畸形的斑馬魚仔魚進行行為分析。斑馬魚運動跟蹤顯示，與對照組相比0.5?μM硒處理的斑馬魚仔魚移動距離明顯縮短，游泳速度較慢，而0.125和0.25?μM硒處理的斑馬魚仔魚在移動速度和距離上沒有顯著差異。此外，在相同的觸摸刺激下，對照組、0.125和0.25?μM組的仔魚反應更快，遠離觸摸針。然而，0.5?μM硒處理組的仔魚對觸摸的反應明顯遲鈍，有些甚至在幾次觸摸后都無法遠離觸摸針。

硒損傷大腦細胞并誘導斑馬魚胚胎神經炎癥：H&E染色顯示，與96 hpf時對照胚胎相比，硒處理胚胎的大腦切片中存在稀疏細胞。此外，透射電子顯微鏡（TEM）檢測顯示大腦中線粒體和核膜結構的破壞。與對照組相比，硒處理的胚胎顯示線粒體內膜減少（假紅色），產生大液泡，并形成松散和折疊的核膜結構（用綠色箭頭標記）。為了剖析硒誘導的神經損傷的機制，用TUNEL法和IF檢測了胚胎大腦中的細胞凋亡和增殖。 結果顯示硒處理的胚胎大腦細胞凋亡增加。IF 表明硒處理的胚胎具有更多的磷酸化 H3 陽性細胞核。 此外，硒處理組的神經炎癥標志物蛋白表達顯著增加。

圖2、96 hpf斑馬魚胚胎大腦組織的結構、細胞凋亡和增殖。（A） 對照組和硒處理組胚胎大腦橫截面的H&E染色分析。黃色矩形代表大腦部分的稀疏細胞。 (B) 斑馬魚胚胎大腦組織的 TEM 切片。 紅色代表受損的線粒體。綠色箭頭表示收縮變形的細胞核。B3-B4是B1-B2中標記的紅色框的放大區域。(C) 通過 TUNEL 檢測 (紅點) 進行細胞凋亡測定。 黃色矩形代表大腦中細胞凋亡的增加。(D) 用 pH3 (綠點) 抗體通過免疫熒光進行細胞增殖測定。 黃色矩形代表大腦細胞增殖增加。

圖3、在96 hpf時，硒激活了斑馬魚仔魚大腦中的神經炎癥。（A） 經硒處理的斑馬魚胚胎大腦切片的代表性IF圖像。GFAP（綠色）。黃色矩形代表星形膠質細胞增多。（B） 經硒處理的斑馬魚胚胎大腦切片的代表性IF圖像。Iba1（綠色）。黃色矩形代表小膠質細胞增多。

硒影響神經元發育和神經遞質傳遞：RNA-seq用于評估過量硒對斑馬魚胚胎的影響。GO分析顯示，硒處理的胚胎中軸突發育、神經元投射再生和神經遞質轉運蛋白活性的轉錄水平顯著改變。定量PCR檢測多巴胺能神經元標記物（sncgb、robo2和otpa）、GABA能神經元標記物（gad1b和gad2）和運動神經元標記物（isl1、isl2a、insm1a和sox2）的表達。在受測基因中，經硒處理的胚胎中sncgb、gad1b、gad2、isl1和isnsm1a表達下調。在 96 hpf 的對照和硒處理的胚胎中也確定了神經遞質傳遞標記基因的表達。 結果表明，在測試的標記基因中，slc6a6b、slc6a19a.1、slc6a19b、slc6a19a.2、slc6a18 和 slc6a2 在 96 hpf 硒處理的胚胎中表達下調，而 slc25a38 表達上調。此外，用抗NSE抗體通過免疫熒光檢查神經元蛋白表達的變化。 結果表明，硒處理的胚胎中神經元靶蛋白的表達下調。

圖 4、 硒處理96 hpf斑馬魚胚胎中神經元相關基因和蛋白質的表達。(A) sncgb、robo2、otpa、gad1b 和 gad2 基因的表達（與多巴胺能和 GABA 能神經元標記有關）。 (B) 基因 isl1、isl2a、insm1a 和 sox2 的表達（與運動神經元標記有關）。(C) 基因 slc6a6b、slc25a38a、slc6a19a.1、slc6a19b、slc6a19a.2、slc6a18 和 slc6a2 的表達（與神經遞質轉運蛋白活性有關）。 (D) 用硒處理的斑馬魚胚胎大腦切片的代表性 IF 圖像。 NSE（綠色）。

PPAR信號參與硒誘導的神經發育和運動缺陷：為了揭示硒誘導胚胎缺陷的潛在機制，使用RNA序列進行了KEGG富集分析。結果表明，硒處理組PPAR信號通路中富集的基因顯著下調。然后，通過qPCR評估相關基因（cd63、pparg、fabp6、slc27a4、fabp1b.1和fabp2）的表達。 與 RNA-seq 結果一致，與對照組相比，硒處理的96 hpf  時胚胎所有這些基因的表達均較低。選擇兩種 PPAR 激動劑羅格列酮和苯扎貝特來評估 PPAR 信號傳導在硒誘導的運動缺陷中的作用。 結果，羅格列酮上調了 cd36、fabp6 和 fabp1b.1 的表達，但下調了 pparg 和 slc27a4 的表達，并導致 硒處理 96 hpf胚胎中 fabp2 表達沒有顯著變化。然而，幾乎所有測試的 PPAR 信號標記基因在 96 hpf 硒 +?苯扎貝特處理的胚胎中均上調。 在神經標記基因方面，在 96 hpf 硒處理的胚胎中，羅格列酮添加上調了 sncgb 和 gad1b 的表達，但下調了 gad2、isl1、slc25a38a 和 slc6a18 的表達。苯扎貝特添加上調 sncgb 和 gad1b、gad2、isl1 的表達，但在 96 hpf 的硒處理胚胎中下調 slc25a38a 和 slc6a18 的表達。還測量了羅格列酮和苯扎貝特組仔魚的觸覺反應。結果表明，PPAR激動劑雖然能恢復某些基因的表達，但不能明顯緩解硒引起的異常觸覺反應。

圖 5、 羅格列酮和苯扎貝特對硒處理96 hpf斑馬魚胚胎中 PPAR 和神經標記基因表達的影響。

順鉑挽救了硒處理的斑馬魚胚胎的運動和神經缺陷：在硒處理的胚胎中補充了一種眾所周知的抗癌藥物順鉑，以評估其對硒神經毒性的影響。斑馬魚胚胎的行為分析表明，順鉑可以恢復硒處理胚胎的正常運動行為和觸覺反應。此外，補充順鉑還能使硒處理胚胎中運動神經元、GABA能神經元、多巴胺能神經元和神經遞質傳遞標記基因的表達恢復到正常水平。此外，還發現順鉑在硒處理的胚胎中恢復了 PPAR 信號標記基因的表達。進行 ICP-MS 以確定順鉑是否影響硒的積累。 結果，添加順鉑并沒有改變胚胎中的硒含量。

圖 6、順鉑對斑馬魚胚胎硒誘導的運動行為缺陷的影響。 對照、對照加順鉑、硒和硒加順鉑組 96 hpf 斑馬魚仔魚的移動軌跡 (A)、距離 (B) 和速度 (C)。

圖7、順鉑對96 hpf硒處理斑馬魚胚胎PPAR和神經標記基因表達及硒含量的影響。

結論：這項研究表明，暴露于過量的硒會導致斑馬魚胚胎出現運動行為功能失調，包括移動速度和距離降低以及對刺激的反應遲鈍。過量硒可增加大腦細胞凋亡和增殖，并調節斑馬魚胚胎神經標志物的表達。此外，補充 PPAR 激動劑羅格列酮和苯扎貝特可以恢復一些神經標記基因的表達，但不能完全挽救硒處理胚胎的運動缺陷。順鉑可以恢復神經和PPAR標記基因的表達，恢復功能失調的運動行為。這項研究將有助于更好地了解斑馬魚體內過量硒的神經毒性。

原文出自：Excessive selenium affects neural development and locomotor behavior of zebrafish embryos - ScienceDirect