TEL:17312606166（魏經理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
摘要：人參皂苷Rg3是人參中主要的甾體皂苷之一，具有多種治療作用。在本研究中，我們通過分析熒光強度、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平，研究了人參皂甙Rg3對高脂飲食（HFD）斑馬魚仔魚模型中脂質積累的影響。還根據體長、體重、體重指數 (BMI)、蘇木精-伊紅 (HE) 染色、油紅染色、定量 PCR、TC 和 TG 評估人參皂甙 Rg3 在 HFD 成年斑馬魚模型中的作用。此外，還測定了斑馬魚中能夠將人參皂苷Rg3代謝為人參皂苷去糖基化酶人參皂苷Rh2和人參皂苷去糖基化原人參二醇的腸道細菌。結果表明，與高膽固醇（HC）組相比，人參皂甙Rg3給予的HFD斑馬魚仔魚模型的局部軀干熒光密度降低。此外，Rg3 治療組的 TC 水平顯著低于 HC 組。然而，兩組之間的TG水平沒有顯著差異。此外，Rg3可以改善HFD引起的相關影響，并使斑馬魚的體長、體重和BMI接近正常水平。肝臟HE和油紅O染色顯示肝細胞有明顯的脂滴聚集和組織病理學變化。Rg3治療可減輕這些變化。Rg3誘導脂質分解代謝相關和合成代謝相關基因的表達，其機制可能與膽固醇合成的下調和膽固醇轉運的上調有關。這些結果反映了Rg3對脂質代謝的影響，表明人參皂甙Rg3可以減少脂肪積累，可能是預防肥胖的潛在藥物。
關鍵詞：人參皂甙Rg3 脂肪堆積 肥胖 斑馬魚
簡介：人參皂苷Rg3是人參中重要的功能活性成分，本研究證實了其減肥作用。這項研究表明，Rg3可以被視為潛在的抗肥胖藥物的候選治療藥物。這項工作將進一步促進人參及其相關產品的開發和應用。肥胖是一種醫學疾病，體內多余的脂肪積累到可能對健康產生負面影響的程度，會增加患各種疾病的風險。大多數肥胖病例是食源性肥胖，例如由高熱量食物或高脂肪和糖攝入引起的肥胖。 食源性肥胖易導致腹腔內脂肪組織堆積，形成脂肪肝。近年來，人們做出了許多努力來尋找和應用替代方法來減少肥胖的影響。對可能影響與肥胖、心血管疾病和糖尿病相關的生物體特定分子途徑的天然生物活性化合物進行了研究。紅參富含人參皂甙Rg3，一種原人參二醇皂苷成分。 該成分的藥用特性，包括免疫調節、抗疲勞、抗糖尿病和抗癌作用已得到證實。人參皂苷 Rg3 在人參根提取物和漿果中的天然含量非常低，但可以通過傳統方法在紅參和黑參中增加，并通過酸或熱處理或生物轉化從甙元人參皂苷去糖基化酶原人參二醇 (PPD) 轉化而來。研究表明，人參皂甙 Rg3 可減少附睪白色脂肪組織的大小、 降低肝脂肪變性、降低小鼠模型附睪白色脂肪組織和肝臟中的 TG 水平。Rg3 還降低肥胖小鼠肝臟 PPAR-γ、C/EBP-α 蛋白、肝臟谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽轉移酶的表達水平。這些結果表明人參皂甙 Rg3 可能是一種潛在的抗肥胖劑。 Rg3 的抗肥胖作用已在小鼠模型中得到證實。斑馬魚的能量平衡調節與哺乳動物相似。斑馬魚是研究代謝疾病的有吸引力的模型系統，因為它們在脂質代謝、脂肪生物學、胰腺結構和葡萄糖穩態中的功能保守。之前報道過人參皂甙Rg3降低了高膽固醇飼料飼養的斑馬魚仔魚的熒光水平。然而，人參皂甙Rg3對斑馬魚脂肪積累的潛在作用及其機制尚不清楚。在這項研究中，用Rg3給予斑馬魚仔魚和肥胖成年斑馬魚。從實驗研究中，我們發現人參皂甙Rg3減少了斑馬魚仔魚的脂肪積累，使斑馬魚的體長和體重接近正常水平。同時，斑馬魚腸道糞便中人參皂甙Rh2和PPD的存在提示Rg3在消化過程中被腸道微生物轉化。脂質代謝關鍵分子的變化為理解人參皂苷Rg3在分子水平上對脂肪積累的抑制作用提供了關鍵線索。這項研究表明，Rg3可以作為抗肥胖藥物的候選藥物。
Rg3對喂飼HFD的斑馬魚仔魚脂質積累的影響：如圖2a所示，熒光密度最高的區域是腹部，主要包含內臟和腸道等器官。結果表明，該部位脂質積累最強。斑馬魚在大約5-7 dpf時開始進食。之前它們唯一的能量來源是胚胎卵黃。在發育的前 4 天，斑馬魚胚胎完全依靠卵黃囊獲取維持其生長和生存所需的營養。當卵黃耗盡時，仔魚必須進食以獲得脂質。 以每克蛋白質含量進行組間比較，以消除個體間生長差異對測定的影響，結果見圖2。考慮到喂食過程中TC和TG的含量在11 dpf之前沒有顯著變化，因此選擇12 dpf作為喂食日。
圖 1 、HFD 仔魚斑馬魚 TC 和 TG 水平。
圖 2. 給予人參皂苷 Rg3 對脂肪堆積的影響。
將含有 25、50 和 100 μg g - 1 人參皂甙 Rg3 和 HFD 的日糧給予 5 dpf 至 16 dpf 的不同斑馬魚仔魚組，每天兩次，持續 1 小時，以測試喂食 HFD 的斑馬魚對 Rg3 干預的反應。圖 2a 顯示了斑馬魚仔魚的熒光顯微鏡圖像。 該圖顯示，在飼喂人參皂甙-Rg3-膽固醇日糧后斑馬魚體內的膽固醇積累減少。檢測 5 條斑馬魚仔魚的 TC 和 TG 水平，進一步了解 Rg3 給予對膽固醇積累的影響。結果顯示，Rg3組TC水平明顯低于HC組。 但各組TG水平與HC組相比無明顯下降。結果顯示，盡管Rg3治療組的體內熒光水平相對于HFD組有所降低，但兩組之間的差異并不顯著。斑馬魚腸道的末端被認為在左邊。 比較不同組的局部干細胞的熒光密度發現，與HC組相比，Rg3-25和Rg3-100組局部干細胞的膽固醇積累顯著降低。膽固醇是動物細胞生物合成的前體，對激素和膽汁酸很重要。然而，膽固醇過高是發生心血管疾病的主要危險因素，心血管疾病是導致健康狀況不佳和死亡的主要原因。之前的實驗已經證明，Rg3抑制3T3L1前脂肪細胞、棕色脂肪細胞和人類原代前脂肪細胞的分化，并減少成熟3T3-L1脂肪細胞中的脂滴積累和大小。這項研究的結果表明，Rg3 減少了 HFD 斑馬魚仔魚模型中的脂肪積累。
Rg3對HFD誘導肥胖成年斑馬魚體重、體長和BMI的影響：成年斑馬魚用普通飼料、SD飼料、HFD或含Rg3的飼料（25、50和100μg/g） 飼喂40天，并對結果進行比較。測量了每組10條斑馬魚的體重和長度。如圖3a-3c所示，隨著攝食時間的延長，HC組斑馬魚的體長在第10-40天增加不超過5%。從第 10 天到第 20 天，體重顯著增加了 20.9%。從第 20 天到第 50 天，體重增加相對緩慢。特別是從第 30 天到第 50 天，體重幾乎沒有變化。然而，第40天斑馬魚的體重最高。在第10天和第20天之間觀察到有很大差異，增加了11.67%。與第10天相比，第20天的BMI呈小幅上升趨勢，第30天后變化可忽略不計。第40天的BMI最大。 雖然第 50 天的 BMI 較第 40 天下降了 3%，但趨于穩定。 一般來說，HFD 對斑馬魚的體長幾乎沒有影響，但對體重有相當大的影響，從而影響 BMI。
圖 3 、人參皂甙 Rg3 的抗肥胖作用
測量每組15條斑馬魚標本的體重和長度。 與 HFD 處理相比，Rg3 給予導致體長整體增加。Rg3-50 和 Rg3-100 組的體長增加尤為顯著。Rg3-25 組相對于 HC 組體重減輕顯著，但與其他組無顯著差異。同時辛伐他汀對斑馬魚體長的影響比對體重的影響更顯著。Rg3-25和Rg3-100組的BMI顯著低于HC組，Rg3-50組的BMI接近正常組。這些結果表明，Rg3可以改善HFD引起的相關影響，從而使斑馬魚的體長和體重接近正常水平。
Rg3對HFD誘導肥胖成年斑馬魚TC和TG水平的影響：每10天采集10條斑馬魚血樣測定TC和TG含量，評價HFD持續時間對高脂斑馬魚模型血脂水平的影響。結果表明， HFD 喂養 40 天后，最高血液 TC 水平達到 20.58 ± 58 ± 0.4 mmol/L。第20～40天TC水平明顯升高，第30天TC含量為15.76±76±0.17 mmol/L，比第20天增加81.65%。第40天TC含量比第30天高30.55%。與前幾天觀察到的變化相比，從第 40 天到第 50 天的下降程度幾乎可以忽略不計。HC組斑馬魚的血TG水平在第40天之前穩步上升，在第40天達到最高水平4.41±0.07mmol/L，然后在第40天之后略有下降。第40天的TG水平比第30天高33.40%，第20至30天的TG水平比第30至40天高24.32%。在第30天之后出現了顯著差異。第 40 天后未觀察到顯著差異。 這些結果表明，高脂肪對斑馬魚血液中TG水平的影響小于對TC水平的影響。人參皂苷Rg3組TC、TG水平低于HC組。不同日糧喂養40天后，Rg3-100組血清TC和TG水平分別下降36.49%和29.97%；Rg3-50組分別增加17.93%和25.83%；Rg3-25組中分別增加13.16%和11.90%。以上兩組數據的研究表明，人參皂苷Rg3可以降低血液中TC和TG的水平，發揮一定的降血脂作用。在 HFD 小鼠中，20(R)-Rg3 通過調節 MAPK 和 NF-κB 信號通路降低血清 TC、TG、LDL-c 和 HDL-c 的水平。Rg3 降低肝臟和 3T3L1 細胞中的 TG 水平。 在 Rg3 給予下，仔魚和成年斑馬魚 TC 和 TG 水平的降低與在細胞和小鼠中觀察到的一致。
圖4、HFD和人參皂甙Rg3對斑馬魚血脂的影響。
人參皂甙 Rg3 在腸道內的轉化：喂養40天后從Rg3給予組收集腸道內容物，以研究人參皂苷Rg3在腸道吸收前的代謝過程。樣品用水飽和正丁醇提取三次。采用薄層色譜法檢測人參皂苷Rg3的轉化率。結果表明，斑馬魚口服Rg3后，Rg3可在胃腸道代謝為人參皂甙去糖基酶人參皂甙Rh2和PPD。人參皂甙和人參皂甙產品是口服的，它們的活性成分不可避免地會進入腸道。在從胃腸道吸收到血液中之前，這些成分可能會被腸道菌群轉化。以往的研究結果表明，在大鼠糞便菌群代謝過程中，人參皂苷Rg3代謝為Rh2和PPD。20(S)-Rg3比20(R)-Rg3更容易吸收，具體而言，口服吸收后，20(S)-Rg3主要分布于小鼠肝臟和胃腸道，其在肝臟中的濃度高于在血漿中的濃度。需要對斑馬魚中Rg3的轉化和吸收進行進一步研究。
Rg3 可防止 HFD 引起的肥胖斑馬魚中的脂質積累：肝脂肪變性是肥胖引起的病理的重要指標。 因此，研究了 Rg3 是否可以減少 HFD 誘導的肥胖成年斑馬魚的肝脂肪變性。用與人參皂苷或辛伐他汀混合的 HFD 喂養 40 天后獲得肝臟樣本，并觀察肝臟的組織病理學。HC組HE染色顯示肝細胞內脂質蓄積明顯， Rg3和辛伐他汀治療組可見少量脂肪泡，肝細胞排列規則。通過肝油紅O染色進一步證實了Rg3的高膽固醇血癥作用。 值得注意的是，用 Rg3 治療 HFD 完全抑制了脂肪浸潤。這一結果證實了Rg3抑制肝臟脂肪積聚的能力。此外，組織學HE和紅油O染色數據顯示，Rg3給予的斑馬魚的脂質成分低于HC組。為了進一步評估 Rg3 對肝臟脂肪堆積的性能，進行了油紅 O 染色的陽性面積比進行定量分析。結果顯示，Rg3治療組的陽性面積比例低于HC組，但依賴性沒有降低。 Rg3 的治療改善了肝臟脂質積累。肥胖可引起肝臟脂肪變性，這是一個重要的指標。在這項研究中，Rg3給予的HFD斑馬魚模型顯示，與HC組相比，肝脂肪變性減少，脂肪含量降低。
圖5、Rg3引起的肝臟問題
HFD誘導肥胖成年斑馬魚肝臟mRNA的表達：HMGCR、LDLR、SREBP2、ABCG1、MTP 和 NPC1L1 是脂質調節中的主要轉錄因子。與HC組相比，人參皂苷Rg3顯著降低斑馬魚肝臟中HMGCR mRNA的表達，Rg3-25、Rg3-50和Rg3-100組HMGCR mRNA表達水平分別下降0.05、0.03 , 和 0.24 倍。在40天的喂養期內，Rg3給予使Rg3-50和Rg3-100組SREBP2的mRNA表達分別上調4.26倍和3.62倍。LDLR 是一種參與膽固醇內吞作用的細胞受體。 從圖中可以看出，與喂食HFD的相比，用Rg3給予的LDLR mRNA水平分別降低了0.26、0.03和0.07倍。Rg3誘導Rg3–50和Rg3–100組的MTP表達。Rg3-50組ABCG1的表達增加了2.78倍，Rg3-100組增加了4.22倍。 轉運蛋白 NPC1L1 的表達在 Rg3-50 和 Rg3-100 組中顯著上調。
圖6、給予人參皂甙Rg3的斑馬魚肝臟的相對mRNA表達。
研究表明，SREBP2 的過表達增加了轉基因小鼠中 HMGCR 的 mRNA 水平。 HMGCR調控的關鍵控制點是限速酶和他汀類藥物的靶點。SREBP家族包括SREBP1a、SREBP1c和SREBP2，是脂質代謝的主要調節者。SREBP2特異性調節膽固醇穩態。膽固醇的吸收始于NPC1L1。研究表明，肝臟NPC1L1在膽汁中吸收膽固醇的過程中起著關鍵作用。
結論：Rg3 是一種從人參中提取的三萜皂苷和主要活性化合物，可為人類提供多種潛在的健康益處。 Rg3可用于治療代謝綜合征。研究了人參皂甙對脂肪細胞和小鼠的減肥作用。在本研究中，研究了Rg3對HFD誘導的斑馬魚肥胖的影響。研究結果表明，Rg3 減少了喂食 HFD 的斑馬魚仔魚的脂肪積累。HC組的熒光強度增加，而Rg3給予組的熒光強度以劑量依賴性方式顯著降低。Rg3治療增加了體重，但對體長沒有顯著影響。Rg3給予降低高脂血癥成年斑馬魚的TC和TG水平。HE和油紅O染色顯示，Rg3給予可調節肝內脂滴的積聚和肝細胞的組織病理學變化。此外，這項研究的結果表明，Rg3 在成年斑馬魚的腸道中轉化為 Rh2 和 PPD。 有必要對斑馬魚血液、組織和器官中 Rg3 的吸收、代謝和積累進行進一步研究。這項工作的觀察結果有助于闡明給予Rg3用于肥胖預防或治療的潛力。
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