TEL:17312606166（魏經理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
摘要：斑馬魚具有增殖快、與人類基因同源性高等優點，是研究心血管疾病必不可少的模式生物。斑馬魚胚胎/幼蟲是毒理學研究中有價值的實驗模型，用于分析藥物毒性，包括肝毒性、腎毒性和心臟毒性，以及臨床前階段的藥物發現和藥物安全篩選。心率 (HR) 可作為心臟毒性研究的功能終點，而心率變異性 (HRV) 可作為心律失常的指標。心臟毒性是藥物試驗早期和晚期終止的主要原因，因此更全面地了解斑馬魚HR和HRV非常重要。本文介紹了心率和心率變異性在特定領域的應用，重點介紹了斑馬魚心跳檢測程序、信號分析技術和成熟的商業軟件，如LabVIEW、Rvlpulse和ZebraLab。我們還比較了 HR 檢測算法和基于心電圖 (ECG) 的心臟信號檢測方法。還系統地分析了 HR 和 HRV 之間的關系； HR被證明與HRV呈負相關。本文還重點介紹了藥物測試的應用。 此外，HR 和 HRV 被證明受自動神經系統的調節；本文還總結了其與ECG測量的聯系。
關鍵詞：斑馬魚心率檢測 HR HRV ECG 自主神經系統 心血管疾病
簡介：斑馬魚作為一種脊椎動物，在毒理學、致畸學、發育生物學和藥理學等領域有著廣泛的應用。斑馬魚模型的其他應用不斷涌現，因為其優勢包括胚胎發育快、身體透明以及與人類的高度遺傳同源性。斑馬魚心臟是第一個發育的器官，對于研究心臟病和心臟毒性的電生理學非常有用。此外，我們的實驗室還證明斑馬魚是研究小分子和肽/蛋白質生物制劑對心臟毒性和心臟保護的藥理作用的一個非常強大和方便的模型。心跳和超聲心動圖（ECG）通常用于量化和臨床評估心臟異常； 然而，數據存儲和信號處理是圖像采集方法的一大挑戰。與手動檢測和觀察相比，自動HR檢測顯示出極大的優勢。心血管疾病（CVD）通常用于指各種疾病，包括高血壓、冠心病、外周血管疾病、心力衰竭、風濕性心臟病、先天性疾病和心肌病。根據世界衛生組織的統計，心血管疾病是全球死亡的主要原因，占全球所有死亡人數的 31%，包括心源性猝死。在中國，心血管疾病占所有死亡人數的40%，給醫療服務帶來沉重負擔。流行病學研究表明，心血管疾病（包括冠心病、心源性猝死、心力衰竭、心房顫動和中風）的風險增加與較高的靜息心率（HR）有關。冠狀動脈疾病、心肌病、先天性心臟病、心臟瓣膜缺陷和心律失常是心血管疾病死亡和中風的主要原因。可以通過測量各種CVD動物模型的心率和心率變異性（HRV）來評估CVD相關疾病。因此，自動準確的心率檢測和心率變異性分析值得更多的關注和深入研究。以前的斑馬魚研究主要集中在心臟再生； 很少有人提到 HR 或 HRV，這就解釋了我們為什么進行這項研究，即總結斑馬魚心臟 HR 和 HRV 測量的最新進展。開創性的研究在斑馬魚表型特征評估方面取得了相當大的成功，并且引入了許多軟件包和工具集來支持自動圖像處理，例如FishInspector，一種自動特征檢測圖形用戶界面。另一個團隊使用最先進的技術調查了許多用于斑馬魚圖像處理的工具，但很少有免費用于教育和研究目的的工具； 大多數僅可用于商業用途。我們總結了最近的斑馬魚心跳檢測和HRV評估工具，以更全面地了解斑馬魚心率檢測和心臟電生理信號分析，包括其在藥物篩選中的應用。檢測斑馬魚心率的現有方法和工具可分為以下幾類：1） 心電圖（ECG）；2） 半自動檢測軟件；3） 自動檢測圖形用戶界面；4） LabVIEW軟件（結合視頻采集設備）；5）人工計數。半自動和自動檢測算法是用于短期視頻記錄的無創技術，似乎適合評估斑馬魚心率。LabVIEW 系列在視頻/圖像采集方面表現良好，包括 HR 和 HRV 分析，但價格昂貴。人工計數是勞動密集型和繁瑣的，并且難以應用于藥物發現背景下的高通量篩選。與 HR 相比，涉及 HRV 的斑馬魚心臟研究較少。 HRV 被公認為預測 CVD 風險和其他由異常自動神經系統 (ANS) 調節引起的相關疾病的重要參數。
基于圖像的心率分析：斑馬魚心臟信號提取和處理的開創性研究引入了許多方法，包括初級斑馬魚養殖、原始圖像和視頻數據采集、ROI 定義以及 PCA 和 ICA 的方法。在下面我們首次系統地總結了這些方法。
原始數據采集：實驗數據采集主要通過單平臺圖像/視頻采集和高通量篩選批量采集完成。逐拍視頻通常在受精后3到4天的斑馬魚幼蟲中采集。斑馬魚胚胎是通過成對和分批雜交收集的。在受精后24小時（hpf），用0.003%的PTU處理胚胎以防止色素形成。斑馬魚胚胎通常在E3培養基中保存在28°C以下。由配備數碼相機的基本光學顯微鏡或具有高分辨率記錄功能的顯微鏡獲取圖像/視頻；在以前的研究中，最好使用640×480像素或更高分辨率的自動顯微鏡每秒15/30幀。
顏色格式：斑馬魚HR數據可以從視頻或圖像中提取。這些數據有助于定位ROI，例如心臟或流動的血管。LAB顏色空間是用于信號分析的顏色空間之一，通過分離內部亮度通道來工作。其他顏色格式包括RGB、CMYK和灰度。對于顏色格式化，不同的檢測方法關注不同顏色通道中像素強度的變化。這些變化發生在一個視頻的連續幀之間，有助于定義ROI。比較來自同一視頻的所有圖像。結果表明，LAB顏色格式有利于識別不同的區域。大多數以前的選擇方法將圖像或視頻顏色轉換為灰度格式，即具有閾值設置的二值圖像。灰度是用于信號處理的最常用的圖像處理方法。
ROI檢測：ROI是指圖像中包含最重要特征或變化最多的區域； 這可能是斑馬魚的大腦、尾巴或心臟區域。在斑馬魚心跳檢測過程中，心房和心室的跳動會改變連續視頻幀中的亮度或暗強度，可以用圓圈或其他形狀來劃分，從而生成ROI。以前的研究手動繪制ROI，而后來的研究則側重于隨著時間的推移自動生成ROI。他們開發了一種算法來根據預定義的 ROI 定義更具適應性的 ROI，以實現可靠的斑馬魚 HR 估計和檢測。識別像素強度變化是定義ROI最有用的策略。另一個研究小組發現斑馬魚體內的紅細胞、色素和碎片的變化會在視頻中產生像素強度的變化，有助于確定ROI。使用亮度強度變化來識別漂移的心臟區域，并計算選定區域的總亮度。通過在選定區域生成遮罩來處理像素強度。已經開發了一個程序來檢測斑馬魚的心臟運動，包括收縮和舒張間期、心率和心律失常；總之，證據表明基于像素強度的策略對于識別斑馬魚心臟區域和提取所需信號是有效的。
信號提取：定義合適的 ROI 后，下一步是提取信號。 Pylatiuk 描述了基于計算視頻中連續幀之間的 ROI 標準偏差的心跳檢測，并將時間序列數據與提取的心跳信號相結合。 然后導出以時間[s]為橫軸，像素強度變化為縱軸的圖表。相鄰的兩個心跳信號最大峰值代表心跳間隔。Krishna首次利用多通道ICA分析斑馬魚HR。此外，PCA 用于從 R、G 和 B 通道中提取信息，提取的最大方差代表斑馬魚心臟活動。ICA算法有助于使用單個通道從未知分量的線性混合中估計信號。2018年，該團隊提出了一種新的基于強度的方法，結合像素強度變化和時間序列數據來生成功率譜密度（PSD），其峰值對HR有貢獻。
信號分析：信號分析是在圖像處理過程中獲得斑馬魚 HR 的關鍵。Pylatiuk利用LabVIEW和MATLAB設計了一個用戶友好的圖形界面，讓研究人員能夠獲得自己的斑馬魚原始數據。當與視頻中的時間序列數據相結合時，PSD 是一種提取重要信息的有效策略。 信號密度在縱軸上，時間在橫軸上。根據PSD數據中的局部最大值（峰值）計算心跳。采用FFT獲取ICA的三通道功率譜。每個通道中最高的 PSD 記錄在每一幀中，這有助于揭示 HR 的模式。斑馬魚心率檢測過程已逐漸標準化。許多研究基于像素強度變化和亮度變化，使用不同的顏色格式來幫助定義ROI。在信號提取和分析方面，通過PCA和ICA逐步從ROI中提取最重要的信息。PSD和FFT是將信息轉換為易于操作的格式的主要方法。進一步處理斑馬魚的心臟信號以檢測心率。另一個新興趨勢是第三方商業化軟件包的發展。 使用這些軟件包的圖形用戶界面 (GUI) 實現了令人難以置信的省力優勢。最常用的軟件包是 ViewPoint 公司的 LabVIEW和 MicroZebraLab，專門從事斑馬魚心臟病學和生理學分析。 這些軟件包有助于檢測心跳和血流。使用商業軟件 DanioScope? 可以在幾分鐘內完成從視頻錄制到 HR 提取的整個過程。斑馬魚心率是反映心臟對環境反應的一個重要參數，促進臨床試驗前心臟病藥物篩選。這些最先進的技術在過去的二十年里都取得了長足的進步。斑馬魚 HR 檢測對于藥物篩選和臨床前研究很重要。 斑馬魚和人類的心臟病表現出高度相似性。斑馬魚的心律失常，包括心動過速和竇性心動過緩。鎮靜劑、麻醉劑和心臟毒性藥物，如MS-222、PTU、可卡因、嗎啉、普萘洛爾、特非那定和異丙腎上腺素，是實驗室測試最廣泛的藥物。例如，MS-222可以降低斑馬魚的心率，從而導致心動過緩。此前的一項研究調查了可卡因及其與其他藥物聯合治療對斑馬魚心臟的影響。可卡因單獨導致心律失常，高劑量導致心動過緩。
ECG：ECG 是一種廣泛使用的技術，用于記錄和分析心臟動作電位 (AP) 和電生理信號。根據先前的研究，這些信號有助于計算人類和成年斑馬魚的 HR 和 HRV。 根據心電圖分析，斑馬魚對化學物質和藥物的心臟生理反應與人類相似，從而產生相似的信號特征，包括心臟去極化、復極化和傳導。有證據表明，斑馬魚心臟的電生理行為與人類心臟非常相似。降低人類 HR 心室 AP 的藥物，如利多卡因、尼群地平和硝苯地平，以及延長 AP 的藥物，如特非那定，對斑馬魚心室有類似的影響。大多數研究創建和應用圖形用戶界面（GUI）以清楚地顯示 HR 和 HRV 的心電圖分析結果。 P波、QRS波群、T波、PR間期、RR間期和QT間期等參數可以通過GUI顯示，便于計算HRV。作為常見的參考指標，QT間期與長QT綜合征（LQT）和QTc直接相關。LQT 的特點是 HR 相關的 QT 間期延長和 T 波異常。 它反映心臟電生理障礙，是室性心動過速的危險因素，甚至可導致猝死。有證據表明，心電圖是量化斑馬魚 HR 和分析 HRV 的有用技術，可提供有關電生理動力學的信息。為了獲取斑馬魚的ECG數據，通常將針電極傳感器或可穿戴設備插入心臟區域，包括心房和心室。這些傳感器通過 ECG 獲取數據以進行進一步處理。 傳感器通常連接到信號放大器以增強信號。此外，可以從這些處理信號中獲得P波、T波、QRS間期、RR間期和QT間期之間的時間延遲。 HR 和 HRV 分析受益于這些信號。在信號處理過程中，使用LabVIEW和MATLAB等商用軟件對信號進行采集、顯示和分析。設計了一種新的傳感器微電極陣列（MEA）膜，并將其放置在斑馬魚心臟的尾部，以將信號傳送到LabVIEW GUI進行進一步處理。這允許實時監測和處理斑馬魚HR和HRV。一項研究將該技術應用于藥物測試，即研究 MS-222 對清醒斑馬魚的影響。在無創數據采集方面取得了顯著的進步。傳感器旨在記錄心電圖活動并監測斑馬魚心臟活動。此外，切除成年斑馬魚的心室，通過觀察心電圖中的心室去極化和復極，研究心臟再生和斑馬魚心律的變化。HR和HRV對于評估斑馬魚的心臟功能至關重要。心電圖也存在局限性；斑馬魚的小尺寸和侵入性切口可能導致心室破裂，這對HR和HRV分析的準確性有重大影響。總體而言，ECG是檢測斑馬魚心率和分析心率變異性的重要技術；它對藥物引起的變化高度敏感。
斑馬魚心率檢測研究進展：心率是心臟活動的重要指標。斑馬魚HR已被廣泛用作藥物毒性的指標。先前的研究產生了各種HR測量方法，包括初始手動計數、半自動檢測算法和自動算法。還開發了第三方軟件來評估斑馬魚的HR。最近，在自動批量篩選和處理方面取得了良好進展，提高了 HR 量化效率。Viewpoint是一家提供行為分析工具的成熟技術公司，專注于斑馬魚胚胎和仔魚的研究，開發了一些軟件包，如Microzebralab和Zebralab，以直接或間接檢測HR。此外，臺灣公司RasVector Technology Inc.開發了RvVisualPulse軟件，通過視頻記錄快速測量心跳。在實際實驗中，測量不是獨立的，可以結合多種技術來全面了解斑馬魚心率。LabVIEW在這方面發揮著重要作用，是一個允許信號處理和提供可視化界面的平臺。LabVIEW常用來分析心電圖數據，使HR檢測更加方便。ECG 技術以及商業軟件和工具包的組合經常用于量化成年斑馬魚心臟的活動。
HRV：在過去的三十年里，斑馬魚 HR 檢測方法在速度、便利性和準確性方面取得了長足的進步。 HRV是指心跳之間時間間隔的變化，以及心跳規律性，而HR代表每分鐘的心跳次數（bpm）。HRV被定義為節律指數。HRV是心肌梗死、心律失常、心律失常、心房顫動和慢性心力衰竭等心臟功能障礙的重要指標。HRV經常用于評估藥物的有效性。一些研究表明，較低的HRV預示著較高的心血管發病率和死亡率，表明HRV的生理重要性。在藥物的動物實驗中，心率變異性檢測越來越受到重視。RR間期代表兩個連續R波之間的時間。 因此，HRV 反映了 RR 間期的變化。心率變異性是心臟異常的重要臨床指標。對于ECG 數據的 HRV 分析，基于 MATLAB 的軟件是有效的。 已開發出微調分析軟件，可自動處理、分類、分析和顯示心電圖信號。有幾種工具用于HRV分析，包括LabVIEW、aHRV、Kubios HRV、HRV工具包、Kaplan軟件、gHRV和PhysioZoo；所有這些應用程序都有GUI，易于操作。
HR 和HRV關系：眾所周知，HR與HRV呈負相關； 較低的 HR 對應較高的 HRV，而 HRV 可以從 HR 中計算出來。 HR 還影響 HRV 作為心血管因素的預測能力。1996 年，歐洲心臟病學會工作組使用 HRV 來描述瞬時 HR 和 RR 間期。首次在清醒成年大鼠和人中系統分析了HRV和HR之間的關系。報告稱較低的 HR 會導致較高的 HRV，并且 HR 不能作為自主神經活動的可靠標志，因為它可能因生物體而異。多項研究通過線性/非線性回歸分析表明 HRV 與 HR 呈負相關。
結論：斑馬魚 HR 檢測與 HRV 相結合可以深入了解心血管風險。 在本次調查中，我們總結了 HRV、ANS、PNS 和 SNS 之間的聯系，以及 HR 和 HRV 之間的關系。我們希望斑馬魚將成為CVD領域更易獲得的藥物篩選生物體， HR和HRV分析可用于臨床前研究。許多常用于斑馬魚HR檢測和HRV分析的工具也可用于其他動物物種的廣泛生理分析。
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