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美鳳力臨床前大動物實(shí)驗(yàn)中心
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腦膜是覆蓋大腦和脊髓的膜狀結(jié)締組織的分層單元。這些覆蓋物包住中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，以便它們不直接接觸脊柱或頭骨的骨骼 。傳統(tǒng)三層腦膜理論認(rèn)為：中樞神經(jīng)系統(tǒng)由硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜分隔。
之前學(xué)者們認(rèn)為，蛛網(wǎng)膜與軟腦膜之間存在一個稱為“蛛網(wǎng)膜下腔”的較大空間。今年Maiken Nedergaard研究團(tuán)隊顛覆性地發(fā)現(xiàn)了在蛛網(wǎng)膜下腔中存在一種特殊的淋巴樣膜，形成了大腦的第四層腦膜結(jié)構(gòu)，被稱為蛛網(wǎng)膜下腔淋巴樣膜（Spider-Like Lymphatic Membrane，SLYM），它在物質(zhì)交換和免疫監(jiān)視方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一發(fā)現(xiàn)重新定義了大腦腦膜系統(tǒng)，其研究成果發(fā)表于Science科學(xué)雜志[1]。
Maiken Nedergaard團(tuán)隊主要利用了Prox1-EGFP+報告小鼠（即Prox1表達(dá)處同時表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探索了大腦周圍的SLYM內(nèi)腦脊液和免疫細(xì)胞運(yùn)輸?shù)慕M織方式。
研究人員通過體內(nèi)雙光子顯微鏡觀察Prox1-EGFP+小鼠體感皮層，發(fā)現(xiàn)在膠原束下方存在一層扁平的Prox1-EGFP+單層細(xì)胞，與松散的膠原纖維混合在一起，形成了SLYM。進(jìn)一步的分析表明，SLYM的厚度約為14.2微米，覆蓋著蛛網(wǎng)膜下腔的血管，而硬腦膜的平均厚度為21.8微米，被膠原纖維包圍。這表示，二者在結(jié)構(gòu)上有明顯的差別。
圖1 活體成像顯示第四腦膜層
此外，全腦結(jié)構(gòu)分析顯示，SLYM與靜脈竇內(nèi)皮細(xì)胞直接相連，為靜脈竇壁上的蛛網(wǎng)膜下腔絨毛樣結(jié)構(gòu)。在人類皮層組織中也發(fā)現(xiàn)了SLYM存在于整個蛛網(wǎng)膜下腔。
為確定SLYM是否構(gòu)成一種不滲透的膜，研究者們通過在Prox1-EGFP+小鼠SLYM兩側(cè)注射紅色熒光微球和藍(lán)色熒光微球，發(fā)現(xiàn)這些熒光團(tuán)并沒有相互滲透。而滲透性實(shí)驗(yàn)顯示SLYM不允許3kDa及以上分子通過，這表明，SLYM是一種屏障，將蛛網(wǎng)膜下腔分成上淺表層和下深層兩個腔室，限制了大多數(shù)肽和蛋白質(zhì)（如β-淀粉樣蛋白和tau）在上下蛛網(wǎng)膜下腔間的交換。
圖2 SLYM代表將蛛網(wǎng)膜下腔空間細(xì)分為兩個隔室的屏障
免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)表明，SLYM中的Prox1-EGFP+細(xì)胞也表達(dá)了其他淋巴標(biāo)記物PDPN和細(xì)胞維A酸結(jié)合蛋白2（CRABP2），表明SLYM與淋巴系統(tǒng)有關(guān)。進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果顯示，SLYM不表達(dá)蛛網(wǎng)膜屏障細(xì)胞層的主要成分CLDN-11，也不表達(dá)蛛網(wǎng)膜小梁的標(biāo)志物淋巴管內(nèi)皮受體1（LYVE1）。這些結(jié)果表明，SLYM是單層組織膜結(jié)構(gòu)而不是管狀結(jié)構(gòu)，并且它表現(xiàn)出一組獨(dú)特的淋巴標(biāo)記。
研究人員還通過雙光子顯微鏡觀察到SLYM中存在大量的白細(xì)胞，而在腹腔注射脂多糖后，SLYM中的白細(xì)胞聚集明顯增加，這種異常聚集也在老年小鼠中觀察到。此外，SLYM中還存在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，表明SLYM是一個關(guān)鍵的免疫細(xì)胞微環(huán)境。
圖3 SLYM擁有大量髓系細(xì)胞
這項研究的重大發(fā)現(xiàn)表明，在小鼠和人類大腦中，都存在著第四層腦膜——SLYM。它包裹著血管并與靜脈竇內(nèi)皮緊密相連，允許腦脊液和靜脈血進(jìn)行物質(zhì)交換；與此同時，SLYM也是免疫發(fā)揮作用過程中的重要角色，為我們了解大腦的免疫功能和液體運(yùn)輸功能提供了嶄新的視角。
在該研究中，Maiken Nedergaard團(tuán)隊利用Prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1（Prox1）作為標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，其靈感或許來源于該團(tuán)隊在2012年發(fā)現(xiàn)的膠質(zhì)淋巴通路，以及2015年腦膜淋巴管的發(fā)現(xiàn)。
Prox1是一種高度保守的、決定淋巴命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有助于淋巴管的形成。它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、晶狀體、視網(wǎng)膜、肝臟、胰腺和心臟等器官的發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且被認(rèn)為是淋巴系統(tǒng)的主調(diào)節(jié)分子。
此外，隨著越來越多的證據(jù)表明Prox1也與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)。Prox1可通過miR-9使E-鈣粘素下調(diào)來促結(jié)腸癌發(fā)展；在肝細(xì)胞癌病例中，它是一種抑癌基因，能抑制促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄因子TWIST1的轉(zhuǎn)錄。Prox1表現(xiàn)出重要的腫瘤抑制和腫瘤增強(qiáng)特性，這取決于腫瘤的起源器官[2]。
隨著研究的發(fā)展，或許從前許多關(guān)于大腦的固有認(rèn)知都將被改寫。
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Prox1-IRES-CreERT2與報告基因小鼠雜交獲得Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+小鼠，經(jīng)tamoxifen處理后，在海馬齒狀回部位實(shí)現(xiàn)特異性表達(dá)。
Fig1. CreERT2-mediated recombination in Dentate Gyrus of Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+ mouse.
也能在眼、心臟、腎臟、胰腺、脾臟、等多種器官中實(shí)現(xiàn)PROX1的時間特異性表達(dá)。
Fig2. Detection of tdTomato(red) in various tissues of Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+ mice. Labeling was also observed in pituitary gland, retina, heart, thymus, stomach, lung, submandibular gland, muscle, ovary, spleen, pancreas and kidney.
參考文獻(xiàn)
[1] M?llg?rd K, Beinlich FRM, Kusk P, Miyakoshi LM, Delle C, Plá V, Hauglund NL, Esmail T, Rasmussen MK, Gomolka RS, Mori Y, Nedergaard M. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 2023 Jan 6;379(6627):84-88. doi: 10.1126/science.adc8810.
[2] Ntikoudi E, Pergaris A, Kykalos S, Politi E, Theocharis S. The Role of PROX1 in Neoplasia: A Key Player Often Overlooked. Diagnostics (Basel). 2022 Jul 4;12(7):1624. doi: 10.3390/diagnostics12071624.
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